不结球白菜开花基因BcMAF2的低温应答及BcFT的互作蛋白筛选

发布时间：2020-07-20 12:18

【摘要】：开花是植物从营养生长到生殖生长的重要转变,是植物生长发育的核心环节。这一质变过程受到内源激素和环境信号的共同调控,研究开花时间的调控机理对蔬菜作物的生产和育种具有重要的经济价值。目前通过对拟南芥开花途径的深入研究,已确认了六条开花途径。开花相关基因构成了复杂的调控网络,不同的开花途径交汇并激活“开花响应元件”,FT基因就是“开花响应元件”之一。本研究对不结球白菜BcMAF2的低温应答机制进行了探索,并通过酵母双杂交技术筛选与BcFT互作的蛋白。主要研究结果如下:1.不结球白菜'苏州青'BcMAF 基因编码一个192氨基酸分子的蛋白质,分子量为21.5×103Da,等电点为6.22,无跨膜区域。BcMAF2蛋白质的N端1～60氨基酸之间含有一个保守的MADS-box结构域,属于MADS-box蛋白,与拟南芥AtMAF2编码氨基酸相似性为72%。亚细胞定位结果显示BcMAF2蛋白不仅位于细胞核,在细胞质、细胞膜中均有分布。以'NHCC004'为材料,通过qRT-PCR分析BcMAF2及其同源基因在持续5周低温(4℃)处理过程中的表达量变化:BcMAF2基因在低温处理第14 d表达水平明显上调;BcFLC2的表达量随春化处理时间的延长而逐渐降低,但在14～28d表达量几乎不变;BcMAF3基因对低温响应最敏感,整个低温处理阶段表达水平明显高于对照,在第28 d达到表达高峰;BcFLM与BcMAF4的表达水平呈现“低～高～低”的动态变化,处理结束时表达量都低于春化前水平。2.诱饵载体pGBKT7-BcMAF2表达产物对酵母细胞无自激活和自毒性。BcMAF2蛋白与BcSVP蛋白在体内和体外均存在相互作用。BcMAF2蛋白还可以与BcFLC2蛋白互作;BcMAF4可形成同源二聚体;拟南芥中AtMAF3可分别与AtFLM、AtMAF4、AtFLC互作,但不结球白菜并无此现象,说明BcMAF3蛋白可能在影响蛋白互作的关键氨基酸位点存在某些化学修饰或突变,阻止蛋白相互作用,有待后续研究;BcSVP可以和BcMAF3外的其它蛋白两两互作,且自身可形成同源二聚体。3.利用亚细胞定位技术研究BcFT的空间表达,发现BcFT蛋白在整个细胞中均有分布。构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-BcFT,验证其表达产物对酵母细胞无自激活和自毒性;对不结球白菜酵母双杂交cDNA文库进行筛选,得到与BcFT互作的两个蛋白BcPPD5和BcVHA-E1。对筛选得到的两个蛋白进行生物信息学分析,预测二者均是亲水性蛋白,不含信号肽,BcPPD5蛋白的氨基酸序列存在一个跨膜区,二级结构中不规则卷曲所占比例最大,163～296氨基酸残基之间存在一个PsbP结构域;BcVHA-E1蛋白无跨膜区,二级结构中α螺旋所占比例最大,无特定结构域。
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S634.3
【图文】：

不结球白菜开花基因尸２的低温应答及ｇｃＦｒ的互作蛋白筛选的分子式为Ｃ９２５Ｈ１５５２Ｎ２７0０３0５Ｓ５，含有１９２个氨基酸，相对分子质量为２１．５ｘ点为６．２２，其中包含正电残基（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）邋２８个，负电残基（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）邋白的不稳定系数为５８．１４，脂肪系数为９７．４０，平均亲水性系数为－０．４９６。Ｐ酸疏水性图谱（图１－１－Ａ）显示该蛋白的Ｃ端和Ｎ端都偏向亲水性，中间疏水性交替出现，总体而言亲水性表现更强。ＤＡＳ、ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ预测区域。根据ＢｃＭＡＦ２的氨基酸序列，利用ＳＯＰＭＡ进行二级结构预测，，ＢｃＭＡＦ２蛋白中ａ螺旋所占比例最大，为４９．４８％；不规则卷曲结构次２３．９６％邋；邋ｐ转角所占比例最少，仅为８．３３％。ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ预测６９？１０６及１７１？１８７氨基酸之间，富集蛋白结合位点，可能是蛋白互作的关键区域。该蛋白１？６０个氨基酸残基之间存在一个ＭＡＤＳ结构域（图１－１－Ｂ）。ＭＡ白通常形成二聚体，以保守的ＭＡＤＳ结构域结合下游基因ＤＮＡｒＧ－ｂｏｘ，实现其调控功能。逡逑

Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ邋ｓｑ邋ｇ逦ｓ邋ｎ邋ｓｇ邋ｅｔｌｐｌｌ逡逑图２－３邋／ＩｒＭ／ｍ和５ｃＡ＾Ｆ２氨基酸序列同源性比较逡逑Ｆｉｇ．邋２－３邋Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ邋ｏｆ邋ａｍｉｎｏ邋ａｃｉｄ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ邋ｏｆ邋ＡｔＭＡＦ２邋ａｎｄ邋ＢｃＭＡＦ２逡逑在拟南芥中，ＪＭＭＦ２有５个同源基因，Ｊ／ＦＺＪｌ／、其逡逑中／ｉｒＦＬＭ位于染色体Ｉ，ＡＦＺＣ位于染色体Ｖ邋，逦在染色体Ｖ上串联逡逑重复排列，形成一个２２－ｋｂ的基因簇。这些基因形成一个小的基因家族，在调控开花逡逑过程中行使各自的功能。与此相似，不结球白菜的同源基因有逡逑ＢｃＦＬＣｌ？ＢｃＦＬＣ３、ＢｃＦＬＭ、ＢｃＭＡＦ３、ＢｃＭＡＦ４，Ｘｉａｏ（２Ｑ＼３、ｉＫ为邋ＢｒＦＬＣ２邋是＆菜邋４邋个逡逑５ｒＦＬＣ＾基因中调控开花的关键基因，在不结球白菜中对应的是５ｃｆＺＣ２。利逡逑用ＤＮＡＭＡＮ８．０软件分析这些同源基因的进化关系，结果如图１－４，与逡逑最先聚类

逦１４０逦１６８逡逑图２－２邋ＢｃＭＡＦ２蛋白二级结构预测逡逑蓝色表示ｏｔ螺旋，绿色表示ｐ转角，红色表示延伸链，紫色表示不规则卷曲逡逑Ｆｉｇ．邋２－２邋Ｓｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＢｃＭＡＦ２邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑Ｂｌｕｅ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ邋ｆｏｒ邋ａｌｐｈａ邋ｈｅｌｉｘ，邋ｇｒｅｅｎ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ邋ｆｏｒ邋ｂｅｔａ邋ｔｕｒｎ，邋ｒｅｄ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ邋ｆｏｒ逡逑ｅｘｔｅｎｄｅｄ邋ｓｔｒａｎｄ，邋ｐｕｒｐｌｅ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ邋ｆｏｒ邋ｒａｎｄｏｍ邋ｃｏｉｌ逡逑２．２邋ＢｃＭＡＦ２氨基酸序列同源性比较及同源基因进化分析逡逑下载拟南芥序列（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ），对拟南芥和不结逡逑球白菜Ｍ４Ｆ２的氨基酸序列进行同源性比较，结果如图１－３，二者氨基酸序列相似度逡逑为７２％

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本文编号：2763433