外源施用萘乙酸调控薄皮甜瓜嫁接愈合的转录组学分析

发布时间：2020-07-25 13:44

【摘要】：薄皮甜瓜(Cucumis melo var.makuwa Makino)是重要的园艺作物,具有很高的经济价值。但在甜瓜实际生产中出现了如连作障碍、土传病害等问题,造成其产量下降,品质降低,嫁接是目前防治主要病害最有效的方法之一。但甜瓜嫁接苗培育中也存在着成本升高、培育周期长等现象。已有研究表明,施用外源植物生长调节剂可以有效促进嫁接苗愈合,缩短嫁接愈合期,提升嫁接苗质量。但是,有关外源施用植物生长调节剂调控嫁接愈合的生理及分子机制尚不清楚。因此,本试验蘸取清水的嫁接苗为对照,以外源施用NAA(萘乙酸)的嫁接苗为处理,薄皮甜瓜‘银泉一号’为接穗,白籽南瓜‘圣砧一号’为砧木,采用顶端贴接法嫁接。首先,利用石蜡切片的技术筛选愈合过程中三个关键时期(隔离层期、愈伤组织形成期,维管束桥形成期)。其次,利用实时荧光定量(qRT-PCR)技术和测定生理生化指标,明确外源施用NAA对薄皮甜瓜嫁接苗愈合关键时期主要保护性酶活性、内源激素含量及其相关基因表达的影响,并利用RNA-Seq技术,来探析外源施用NAA对薄皮甜瓜嫁接苗愈合关键时期主要代谢途径及差异表达基因的影响,以期能够系统分析外源NAA调控甜瓜嫁接愈合的生理及分子机制,为进一步提高嫁接效率提供理论和实践基础。主要研究结果如下:1.外源施用NAA对薄皮甜瓜嫁接苗愈合过程中组织学变化的影响:通过石蜡切片观察发现,对照植株在嫁接后第2 d形成隔离层,第6 d后形成愈伤组织,第9 d后形成新的维管束桥,完成愈合过程。外源NAA处理对薄皮甜瓜嫁接苗愈合过程中隔离层的形成无明显影响,但愈伤组织和维管束桥形成期均比对照提前1d。表明外源NAA处理能够有效地促进薄皮甜瓜嫁接苗愈合。2.外源施用NAA对薄皮甜瓜嫁接苗愈合过程中相关酶活性及其相关基因表达的影响:薄皮甜瓜嫁接苗愈合过程中,外源NAA处理后SOD、POD酶活性呈先升高后降低的趋势,在愈伤组织形成期达到最高值,且酶活性显著高于对照,PAL酶活性在愈合过程中均高于对照,且在维管束桥形成时期达到最高值。PPO酶活性在隔离层形成期显著高于对照,随后其活性略低于对照,但差异不显著。除CmPOD外,外源NAA处理能够显著提高CmFe-SOD、CmCu-Zn-SOD、CmMn-SOD、CmPPO相对表达量,且其变化趋势与酶活性基本一致。表明外源施用NAA诱导了关键酶相关基因的表达,从而使酶活性升高,促进愈合过程。3.外源施用NAA对内源激素含量及生长素合成相关基因的影响:外源施用NAA后,除GA_3外,IAA、ZR、ABA三种激素含量在愈伤组织和维管束桥形成期均显著高于对照。且在隔离层形成时期诱导了CmYUC10的表达,在愈伤组织形成时期诱导了CmYUC4、CmYUC6基因的表达,而CmYUC8在嫁接愈合整个过程中的表达量均高于对照,并且在愈伤组织形成期显著高于对照。表明外源施用NAA显著提高了植物激素的含量,并在愈合过程中诱导了生长素合成基因的表达,促进愈伤和维管束桥的发育。4.外源施用NAA对薄皮甜瓜转录组学特征的影响:在南瓜和甜瓜基因组中共检测了20996个基因,经过差异基因的筛选,在对照中共筛选出532个差异基因,外源NAA处理后共筛选出4212个差异基因。然后对差异基因进行GO、KEGG分析,发现在甜瓜和南瓜基因组中基因富集最多的是植物激素信号转导途径和木质素合成途径。并且这两条途径与愈合过程紧密相关。外源施用NAA后在嫁接后期四种激素(IAA、ABA、GA_3、ZR)信号转导相关基因的表达高于对照,变化趋势与激素含量变化趋势基本一致,在嫁接初期,对照嫁接苗与木质素合成相关基因表达量高于NAA处理,而在愈合后期则相反。表明外源施用NAA后差异基因数量增多,参与的代谢活动更多,为愈合过程提供更多的物质基础。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S652
【图文】：

拟南芥,番茄,进程,木质部

前言DIFIFENTIATION 1（WIND1）激活周围伤口，WIND1 的表达可显著促进细胞去分化和细胞分裂以形成伤口诱导的愈伤组织（Iwase et al., 2011）。同时，转录因子 WIND1 在嫁接接合点上方显著上调（Melnyk et al., 2015），并推测转录因子 WIND1 可能在细胞分裂素信号转导的上游起作用。大多数植物具有组织黏连的功能，并在切断维管束桥后的伤口处能够重新连接其维管系统。植物维管系统为器官间交流与协调提供了重要的途径。木质部主要运输水分和矿物质，韧皮部筛管系统则从源叶向发育中的库器官传递光化学物质以及信息分子，其中包括激素，蛋白质和 RNA 转录物（Giavalisco et al., 2006）。Yin 等人（2012）发现拟南芥嫁接 3d 后植物恢复了运输能力，证明已经完成了愈合过程中最关键的事件，即维管束桥的成功连接。但 Melnyk 等人（2015）研究发现，砧木和接穗的重连具有组织不对称性。嫁接口上部新的木质部导管在嫁接后 4-5d 形成，而嫁接口下部新的木质部的形成则发生在 5-6d，同时在韧皮部重连过程中也有类似的现象。同时，研究也表明，砧木和接穗重连的组织不对称性是因为切割后的伤口应答，细胞分裂，木质部分化和凯氏带形成基因（CASP1）的表达在嫁接接合点上方被激活所导致的。

维管组织,生长素,植物,韧皮部

发现低浓度的外源 IAA 施用于离体的培养茎段中维管再生部位，可以刺激韧皮部的分化，而高浓度外源 IAA（1.0% w/w）可以诱导木质部的分化。图2 生长素在植物维管组织中的作用（Carlo et al., 2013）Fig.2 The role of auxin in plant vascular tissue（Carlo et al., 2013）图注：[↓]，降低浓度; [↑]，增加浓度; Dh，管道直径Cr 形成层区域，Ec扩大的木质部细胞，MXy 成熟木质部，Ph韧皮部。

外源,酶活性,隔离层,愈伤组织形成

PPO 活性越高，隔离层存在的时间就越长，嫁接愈合时 PPO 活性越低，嫁接苗就越容易愈合，可见，在愈伤组织形成时期开始，NAA 处理后隔离层存在的时间较对照短。图4 外源施用NAA对嫁接愈合过程中相关酶活性的影响Fig.4 Effects of exogenous application of NAA on the activities of related enzymes during graft healing图注：CK为对照，NAA为处理，IL:isolated layer（隔离层），CA:callus（愈伤组织），VB:vascular bundle（维管束桥）（下同）3.2.2 外源施用 NAA 对愈合过程中内源激素的影响在嫁接初期，由于伤口的存在，生长素运输受阻，含量呈下降的趋势，随着愈合过

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