云南金花茶遗传多样性分析及其离体快繁研究
发布时间：2020-07-28 10:14
【摘要】：云南金花茶是云南特有极小种群植物,已列入云南省2010~2015年的极小种群物种拯救保护紧急行动计划。按照IUCN评估标准,该种属于 极危种‖(CR A1c)等级。试验采用SSR分子标记技术分析云南金花茶不同种群的遗传多样性,阐述不同种群云南金花茶的遗传变异情况,并以带叶腋的嫩茎为外植体进行组织培养试验,比较不同消毒时长、培养基种类及激素浓度对云南金花茶外植体消毒效果、增殖培养及生根培养的影响情况,建立一套完整、稳定的云南金花茶离体快繁体系。主要研究结果如下:1、利用转录组测序技术,一共获得了95,979条含SSR位点的EST序列,丰富了云南金花茶EST数据库,并从中筛选获得了14对具有多态性的引物,单个多态性位点的等位基因数为2~8个,共扩增出68个等位基因,位点平均等位基因数为4.8571,位点的平均有效等位基因数为2.7130。平均Shannon’s信息指数I为1.0925,表现出较高的多态性。2、云南金花茶8个群体多态性位点百分率(PPB)在42.86%~100%,不同群体间存在着明显的遗传参数差异,多态性均较高。基因流(Nm)值范围在0.0503~0.9820之间,平均值为0.54401,说明云南金花茶群体间的基因交流程度较低。通过遗传结构分析将8个群体大致分为3个类群,遗传变异主要发生在群体内,占总变异的49.95%。3、研究发现云南金花茶具有较高的遗传多样性,其丰富的遗传多样性可能是由于分布区的生境多样化和物种较长的进化历史所决定的,自然群体之间几乎没有基因交流,群体分化水平较低。4、以云南金花茶幼嫩茎段为外植体,用75%酒精消毒10s,0.1%升汞消毒10min后,接种在培养基MS+6-BA 2.0 mg/L+IAA 0.5 mg/L中培养,污染率为15%,腋芽诱导率达90%,不定芽生长良好;WPM培养基适宜作为云南金花茶组织培养的基本培养基。最佳增殖培养基为WPM+6-BA 3.0 mg/L+IAA 0.3 mg/L,增值系数为6.83,平均苗高3.5cm,苗粗壮、长势好;1/2 MS+IBA 2.0 mg/L+NAA0.3 mg/L+0.3 g/L AC为云南金花茶生根培养的最佳培养基,在此培养基上,生根条数平均为4条,生根率为100%;云南金花茶组培苗移栽至红土:腐殖土=2:1基质中,50d后成活率达95%,幼苗长势好。
【学位授予单位】：西南林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S685.14
【图文】：
西南林业大学硕士学位论文18图1 不同重复基元的比例Figure 1 The percentage of different motifs repeats2.4.3 EST-SSR 引物筛选利用云南金花茶部分样品开发 EST-SSR 多态性引物，采用 1.5%的琼脂糖电泳凝胶对 SSR-PCR 扩增产物进行初步结果检测。初步获得了 50 对条带清晰、反应稳定的 EST-SS 引物，经琼脂糖凝胶检测条带单一、明亮、无拖尾，特异性引物与模板 DNA 链之间有很高的结合（图 2）。见图 3，而有部分 SSR 引物 PCR产物出现两条带和拖尾现象，说明这些引物扩增出了非特异性条带；另外，有部分扩增条带较暗，甚至有的完全没有扩增出条带，表明该引物的特异性不强，不能与模板 DNA 很好的结合，应当选择弃用，但也有可能是因为所用的模板 DNA的质量较差，从而影响了与引物之间的结合，需重新提取高质量的 DNA 模板。
2 云南金花茶遗传多样性分析19图2 引物与部分模板DNA的PCR扩增结果Figure 2 Primer and partial template DNA PCR amplification products图3 引物与部分模板DNA的PCR扩增结果Figure 3 Primer and partial template DNA PCR amplification products2.4.4 引物多态性检测把初步筛选获得的 50 对EST-SSR 引物的扩增产物送至昆明硕擎生物科技有限公司进行毛细管电泳检测，应用 MEGA7 和 MUSCLE 软件对检测得到的序列进行比对及校正，最后用 Excel 2003 进行扩增片段测序的统计，并对统计结果采用 GenAlEx 6.5 软件分析每个位点的多态性。结果表明，14 对引物的具有多态性，各位点部分样品扩增的荧光检测结果如图 4。并将这 14 对 EST-SSR 引物的序列信息提交到 NCBI 数据库中，进行 Blast 比对分析，发现其中有 6 对引物所在的基因序列具有明确的基因注释
图2 引物与部分模板DNA的PCR扩增结果Figure 2 Primer and partial template DNA PCR amplification products图3 引物与部分模板DNA的PCR扩增结果Figure 3 Primer and partial template DNA PCR amplification products2.4.4 引物多态性检测把初步筛选获得的 50 对EST-SSR 引物的扩增产物送至昆明硕擎生物科技有限公司进行毛细管电泳检测，应用 MEGA7 和 MUSCLE 软件对检测得到的序列进行比对及校正，最后用 Excel 2003 进行扩增片段测序的统计，并对统计结果采用 GenAlEx 6.5 软件分析每个位点的多态性。结果表明，14 对引物的具有多态性，各位点部分样品扩增的荧光检测结果如图 4。并将这 14 对 EST-SSR 引物的序列信息提交到 NCBI 数据库中，进行 Blast 比对分析，发现其中有 6 对引物所在的基因序列具有明确的基因注释
本文编号：2772736
【学位授予单位】：西南林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S685.14
【图文】：
西南林业大学硕士学位论文18图1 不同重复基元的比例Figure 1 The percentage of different motifs repeats2.4.3 EST-SSR 引物筛选利用云南金花茶部分样品开发 EST-SSR 多态性引物，采用 1.5%的琼脂糖电泳凝胶对 SSR-PCR 扩增产物进行初步结果检测。初步获得了 50 对条带清晰、反应稳定的 EST-SS 引物，经琼脂糖凝胶检测条带单一、明亮、无拖尾，特异性引物与模板 DNA 链之间有很高的结合（图 2）。见图 3，而有部分 SSR 引物 PCR产物出现两条带和拖尾现象，说明这些引物扩增出了非特异性条带；另外，有部分扩增条带较暗，甚至有的完全没有扩增出条带，表明该引物的特异性不强，不能与模板 DNA 很好的结合，应当选择弃用，但也有可能是因为所用的模板 DNA的质量较差，从而影响了与引物之间的结合，需重新提取高质量的 DNA 模板。
2 云南金花茶遗传多样性分析19图2 引物与部分模板DNA的PCR扩增结果Figure 2 Primer and partial template DNA PCR amplification products图3 引物与部分模板DNA的PCR扩增结果Figure 3 Primer and partial template DNA PCR amplification products2.4.4 引物多态性检测把初步筛选获得的 50 对EST-SSR 引物的扩增产物送至昆明硕擎生物科技有限公司进行毛细管电泳检测，应用 MEGA7 和 MUSCLE 软件对检测得到的序列进行比对及校正，最后用 Excel 2003 进行扩增片段测序的统计，并对统计结果采用 GenAlEx 6.5 软件分析每个位点的多态性。结果表明，14 对引物的具有多态性，各位点部分样品扩增的荧光检测结果如图 4。并将这 14 对 EST-SSR 引物的序列信息提交到 NCBI 数据库中，进行 Blast 比对分析，发现其中有 6 对引物所在的基因序列具有明确的基因注释
图2 引物与部分模板DNA的PCR扩增结果Figure 2 Primer and partial template DNA PCR amplification products图3 引物与部分模板DNA的PCR扩增结果Figure 3 Primer and partial template DNA PCR amplification products2.4.4 引物多态性检测把初步筛选获得的 50 对EST-SSR 引物的扩增产物送至昆明硕擎生物科技有限公司进行毛细管电泳检测，应用 MEGA7 和 MUSCLE 软件对检测得到的序列进行比对及校正，最后用 Excel 2003 进行扩增片段测序的统计，并对统计结果采用 GenAlEx 6.5 软件分析每个位点的多态性。结果表明，14 对引物的具有多态性，各位点部分样品扩增的荧光检测结果如图 4。并将这 14 对 EST-SSR 引物的序列信息提交到 NCBI 数据库中，进行 Blast 比对分析，发现其中有 6 对引物所在的基因序列具有明确的基因注释
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1 李斌;云南金花茶遗传多样性分析及其离体快繁研究[D];西南林业大学;2018年
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