火龙果HubHLH1-like基因的克隆及功能分析

发布时间：2020-08-02 12:27

【摘要】：火龙果(Hylocereus undatus)是仙人掌科三角柱属一种果用栽培品种,其外形独特,果肉鲜美,营养丰富,深受消费者喜爱,具有重大的经济、社会及商业价值。贵州精品水果建设已将火龙果列为第一重点支持产业,然而受喀斯特山地生态环境的影响,火龙果在生长发育过程中会遭受干旱、高温、盐碱等各种逆境胁迫的影响,造成产量和品质的下降。转录因子是一种对基因的表达调控起重要作用的蛋白分子,参与调控植物抗逆性、生长发育等众多生物学过程,bHLH转录因子是一类具有独特HLH结构域的蛋白家族,该类转录因子与植物的生长发育、色素合成、信号转导、营养吸收和逆境胁迫应答等都有着密切的关系。目前,火龙果中尚无有关bHLH家族基因的研究报道,实验室前期成功构建了抗旱相关基因富集的SSH-cDNA文库,筛选获得一个在干旱胁迫下差异表达的火龙果bHLH转录因子EST片段,因此,在火龙果中开展bHLH转录因子家族基因的研究,将丰富火龙果在逆境胁迫下的分子调控机理,特别是逆境胁迫下火龙果的抗逆转录调节机制,为火龙果的抗逆分子育种和种质创新提供理论依据。本文以生长势及抗逆性较强的火龙果品种“紫红龙”为实验材料,克隆获得了一个与逆境胁迫相关的转录因子HubHLH1-like,并对它的序列特征、亚细胞定位、不同非生物胁迫和激素处理下的表达模式进行分析,进而通过构建基因过表达载体遗传转化烟草初步进行功能分析,主要研究结果如下:1.采用RT-PCR和RACE等技术,克隆了火龙果“紫红龙”bHLH转录因子基因的cDNA全长,命名HubHLH1-like。该基因全长2,343 bp,开放阅读框(ORF)1,221bp,编码406个氨基酸,其编码产物含有典型的HLH保守结构域。预测分子量45.19 KD,理论等电点8.65。氨基酸序列比对结果表明HubHLH1-like与其他高等植物bHLH蛋白具有较高的同源性,且在HLH功能结构域上保守程度较高。系统进化分析表明,HubHLH1-like与双子叶被子植物可可碱性螺旋-环-螺旋DNA结合蛋白(XP_007014952.1)同源性最高,亲缘关系最近。2.通过构建瞬时表达载体pBWA(V)HS-HubHLH1-like-GFP,将目的基因与绿色荧光蛋白GFP融合,并采用PEG介导的电化学法瞬时转化水稻原生质体,共培养后观察目的基因的亚细胞定位,结果显示HubHLH1-like定位在细胞核,具有核定位信号,符合转录因子的特性。3.利用qPCR技术分析HubHLH1-like基因在不同逆境下的表达,结果显示,在干旱、高温、低温胁迫下,该基因上调表达;在干旱胁迫5 d时表达量最高,10 d最低,干旱胁迫5 d时的表达量约为干旱胁迫10 d时的4倍,干旱胁迫20 d后该基因表达量仍处于较高水平。HubHLH1-like在高温和低温胁迫下上调表达,同时其表达量受SA、ABA、H2O2的诱导,且不同处理下该基因具有不同的表达模式,外源SA能够增强该基因的表达。4.构建了HubHLH1-like基因超表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法将HubHLH1-like基因转化模式植物烟草。经过筛选与PCR分子检测,成功鉴定了10个能够正常表达目的蛋白转基因烟草株系,qPCR检测结果表明,HubHLH1-like基因在10个转基因烟草株系中,5号株系(Line-5)表达量最高,9号(Line-9)次之,3号株系(Line-3)表达量最低,研究结果为下一步功能验证奠定了基础。
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q943.2;S667.9
【图文】：

质量检测,内参,基因,幼嫩茎段

2.3 结果与分析2.3.1 总RNA提取及反转录检测图2-1 总RNA质量检测A:总RNA；B:内参基因Actin/PCR扩增；M：DL2000Fig. 2-1 Quantification analysis of extracted total RNA and cDNAA: Total RNA; B: Amplification of Actin gene; M: DL2000高质量的植物总RNA提取是基因全长克隆成功的关键，本实验采用离心柱法提取火龙果幼嫩茎段总RNA，通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，电泳结果（图2-1，A）显示RNA条带无拖尾现象，18S和28S条带清晰可见，并且28S条带亮度约为18S的两倍，说明提取的RNA质量好

cDNA序列,基因,PCR扩增,非翻译区

贵州大学 2017 届硕士研究生学位论文23图2-2 “紫红龙”HubHLH1-like基因PCR扩增注：1:HubHLH1-like 基因3’-RACE；2：HubHLH1-like基因5’-RACE；3：HubHLH1-like基因的ORF片段；M：DL 2000 markerFig. 2-2 Electrophoretogram of HubHLH1-like RACE PCR amplificationNote:PCR product showing the 3’-RACE (1), 5’-RACE (2), the ORF (3) of HubHLH1-like usingspecific primers；M, DL 2000 marker2.3.3 HubHLH1-like基因cDNA全长及ORF的获得将3’、5’-RACE所得到的基因片段序列与中间片段进行拼接，得到全长2,343bp的HubHLH1-like基因cDNA序列，利用ORF Finder对拼接的全长进行开放阅读框预测，获得HubHLH1-like基因的开放阅读框大小为1,221 bp，共编码406个氨基酸，非翻译区5’-UTR大小235 bp，非翻译区3’-UTR大小为887 bp，用Primer Premier5.0在开放阅读框两端设计引物HubHLH1-like-Full-F和HubHLH1-like-Full-R进行PCR扩增

氨基酸序列,氨基酸序列,序列,红色

图 2-3 HubHLH1-like cDNA 序列及其推测的氨基酸序列Fig. 2-3 The complete cDNA sequence and amino acids sequences of the proteinencoded by HubHLH1-like注：红色划线部分代表 HLH 结构域；红色方框为起始密码子，星号代表终止密码子。Note: The amino acid sequence is displayed in a one-letter code under the coding sequence,with the underlined amino acids in red representing the HLH domain. The translation start codonis framed, the asterisk denotes the stop codon.2.3.4 HubHLH1-like的生物信息学分析2.3.4.1 HubHLH1-like蛋白结构域与氨基酸序列比对分析使用NCBI的CDD（Conserved Domain Database）数据库，对“紫红龙”HubHLH1-like全长序列中可能存在的蛋白结构功能进行预测，预测结果表明HubHLH1-like蛋白在340aa-389aa位有一个HLH保守结构域，且HLH区域位于C末端，可参与形成同型或异型二聚体，调控基因的转录。通过GenBank accession数据库（http://www.ncbLnlm.nih.gov/Genbank/update.html)进行登录，命名HubHLH1-like，获得基因登录号：KU976397.1。

【参考文献】