DNA甲基化影响蓝莓果实花青苷积累机制初探

发布时间：2020-08-02 18:00

【摘要】：DNA甲基化是一种重要的表观遗传机制,在不改变DNA分子一级结构的情况下调节基因的功能。植物中主要包括四种胞嘧啶甲基转移酶:维持DNA甲基转移酶METs家族、结构域重组甲基化酶DRMs、染色质甲基化酶CMTs与DNA甲基转移酶Dnmt2家族。花青苷是蓝莓主要的代谢产物之一,具有重要的营养和市场价值。目前有关蓝莓花青苷研究主要集中在合成路径调控与代谢、提取方法的改进等,鲜有关于DNA甲基化和去甲基化基因对花青苷生物合成的影响。本实验选取南高丛蓝莓品种'奥尼尔'和'蓝雨'为研究试材,分离DNA甲基化、去甲基化以及花青苷合成相关基因,采用实时荧光定量法(qPCR)分析各基因在果实生长发育阶段的表达水平,通过比较转色期前后花青苷含量差异,以及花青苷合成关键基因启动子中的甲基化变化,分析DNA甲基化和去甲基化基因对花青苷生物合成可能的影响。具体研究结果如下:(1)分别分离出蓝莓DNA甲基化基因VcMET1、VcDRM2、VcCMT3和去甲基化基因VcDME1cDNA序列各一条。分析推导的氨基酸序列发现,4个基因均包含植物中高度保守的结构域:VcMETl包含2个N端调控区的复制叉作用位点DNMT1-RFD结构域,2个参与DNA甲基化、复制与转录调控的BAH及1个胞嘧啶甲基转移酶Dcm结构域;VcDRM2包含1个泛素相关结构域UBA与1个S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)依赖的甲基转移酶结构域;VcCMT3分别包含1个BAH、Dcm及染色质结构修饰结构域CHROMO;VcDMEI分别包含1个RRM_DME,一个编码螺旋发夹结构的HHH super family以及一个可被Demeter-like蛋白探测的Perm-CXXC蛋白结构域。qPCR分析发现,VcMET1和VcCMT3随着果实的发育表达量逐渐下降,在果实发育的后期甚至检测不到;除在'蓝雨' S6和S7期高表达外,VcDRM2在整个果实发育期间mRNAs相对较低,且呈平缓下降状态;与DNA甲基化基因类似,去甲基化基因VcDME1在果实发育时期阶段的表达也呈现下降趋势。(2)根据报道的蓝莓花青苷合成相关基因VcANS、FcDFR、VcCHS、VcF3H和VcUFGT基因序列,分离并研究这些基因在'奥尼尔'与‘蓝雨'果实发育进程中的表达模式,发现其表达模式上高度一致,呈现上升-下降-上升-下降的动力学变化趋势。(3)蓝莓果实中花青苷主要积累在果皮,果实从S5期开始积累花青苷,随后花青苷含量迅速增加;S5期果实呈白色或浅绿色,Br期1/4的蓝莓果实呈浅红或浅紫色,到S6期果实转变成深蓝色。pH示差法分析表明3个时期花青苷的含量分别是0.005、0.22和2.63 mg/g.FW。比较同时期花青苷生物合成相关基因的表达,发现这些基因在花青苷积累之前表达丰度较高,花青苷的积累对其基因表达呈现反馈调控。(4)采用同源克隆法分离出'奥尼尔'与'蓝雨'花青苷合成相关基因VcANS、VcDFR、VcCHS、VcF3HccUFGT启动子序列;利用启动子分析软件PlantCARE预测发现,光响应元件占40.30%,推测蓝莓花青苷生物合成受光信号影响较大。(5)对花青苷合成相关基因VcANS和FcCHS启动子序列的胞嘧啶变化分析发现,VcANS启动子从S5期-Br期-S6期中分别有2个、10个和8个胞嘧啶被甲基化,在转色期前后仅在3个转录起始位点(两个TATA-box和一个CAAT-box)发生改变;VcCHS启动子从S5期-Br期-S6期中分别有2个、2个和4个胞嘧啶被甲基化;另外,VcANS和VcCHS启动子甲基化位点分别存在序列反义链上的CAAT-box区域和5'-UTR Py-rich stretch区域,属于高转录水平的顺式作用元件,影响花青苷相关基因的转录表达,推测低甲基化状态下的启动子序列促进基因的表达。
【学位授予单位】：浙江师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S663.9
【图文】：

蓝莓果,奥尼尔,取样点

ｃｏｒｙｍｂｏｓｕｍ）邋‘奥尼尔’与＇蓝雨’果实，参考叶强对蓝萄果实发育时期的分类，取逡逑特定时期样品，每个时期采样２０－５０个果实。以‘奥尼尔’为例，蓝莓果实取样时状逡逑态参见图２．１。其中，以蓝莓花芽即将开放为铃铛花期为界限，即Ｓ０期，ＳＯ－Ｓ７表示逡逑蓝莓果实发育后期，即果实发育各个时期。铃铛花期（Ｓ０）之前样品需去除花瓣，仅逡逑保留子房和花托。Ｓ５期及以后的果实取回后，迅速用手术刀切成小块。处理后的样品逡逑经液氮速冻后，冻存于－８０°Ｃ备用。逡逑图２．１邋‘奥尼尔’蓝莓果实发育过程中各时期取样点逡逑Ｆｉｇ．２．１邋Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ邋ｓｔａｇｅｓ邋ｏｆ邋Ｖ．邋ｃｏｒｙ＾ｍｂｏｓｕｍ邋（ｃｖ邋Ｏ＇Ｎｅａｌ）邋ｆｒｕｉｔｓ邋ｕｓｅｄ邋ｉｎ邋ｔｈｉｓ邋ｓｔｕｄｙ逡逑１．２载体与菌株逡逑实验采用载体为ＰＭＤ１９－Ｔ，菌株为大肠杆菌ＤＨ５ｃｔ，菌种由实验室保存。逡逑１．３试剂与仪器逡逑主要试剂有：２ｘｐＦｕ邋Ｍａｓｔｅｒ邋Ｍｉｘ购自北京康为世纪生物科技有限公司；逡逑ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ？Ｉｓｔ邋Ｓｔｒａｎｄ邋ｃＤＮＡ邋Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋Ｋｉｔ、ｐＭＤｌ邋９－Ｔ邋ｖｅｃｔｏｒ、ＳＹＢＲ？Ｐｒｅｍｉｘ邋Ｅｘ邋Ｔａｑ？ＩＩ逡逑（ＴｌｉＲＮａｓｅＨ邋Ｐｌｕｓ）购自宝生物工程（大连）有限公司；ＯＭＥＧＡ柱式ＤＮＡ胶回收试逡逑剂盒购自上海生工生物技术有

序列,蓝莓,奥尼尔,质量分析

Ｆｉｇ．３．１邋Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ邋ｃｏｎｔｅｎｔ邋ｖａｒｉａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ．Ｌ邋＇Ｏ＇Ｎｅａｌ＇逡逑３．２邋ＲＮＡ质量分析逡逑如图３．２所示，采用ＣＴＡＢ－ＫＡｃ法提取‘奥尼尔’与‘蓝雨’果实总ＲＮＡ。图中逡逑２８Ｓ邋ｒＲＮＡ与１８Ｓ邋ｒＲＮＡ条带清晰明亮，２８Ｓ邋ｒＲＮＡ条带亮度在１８Ｓ邋ｒＲＮＡ的１．５－２．０倍逡逑之间，表明提取过程中ＲＮＡ几乎未发生降解。两种蓝莓总ＲＮＡ如以２３0比值大于２．０，逡逑先６0／先８0比值在２．０左右，说明ＲＮＡ无蛋白质、酚类和多糖等污染。数据结果表明提逡逑取出的样品总ＲＮＡ质量良好，可进行后续ｑＰＣＲ等分子操作。逡逑蓝莓品种逦奥尼尔蓝雨逦逡逑２８Ｓ邋ｒＲＮＡ邋—逡逑ｒＲＮＡ邋—逡逑图３．２总ＲＮＡ提取逡逑Ｆｉｇ．３．２邋Ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ逡逑３．３蓝莓花青苷合成相关基因的分离逡逑通过普通邋ＰＣＲ，引物参考表邋３．１，利用邋ＮＣＢＩ邋数据库（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）逡逑已经发布的蓝莓序列，从‘奥尼尔’叶片中分别成功分离出Ｋｄ、ＦｃＺ）尸ｉ？、ＦｃＣ／＾、逡逑ＦｃＦ３／／和ＦｃＪＴＦＧｒ。测序序列表明５个基因的开放阅读框分别包含１，０７１邋ｂｐ，邋ｌ，０３８ｂｐ，逡逑１

DNA甲基化影响蓝莓果实花青苷积累机制初探

图３．２总ＲＮＡ提取逡逑Ｆｉｇ．３．２邋Ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ逡逑

【参考文献】