洋葱果胶甲酯酶基因AcPME的克

发布时间：2020-08-02 18:52

【摘要】：洋葱(Allium cepa L.)在分类学上属于天门冬目石蒜科葱亚科葱属(APGIII)蔬菜作物,广泛栽培于世界各地。因其基因组巨大(15,290 Mbp/C),分子生物学基础领域的研究相对薄弱,主要集中在育性、颜色相关基因的分子标记上,而关于洋葱功能基因的研究甚少。果胶甲酯酶[pectin methylesterase,PME]是一类催化果胶复合物中甲酯化的D-半乳糖醛酸单元去甲酯化的一类细胞壁蛋白,根据其保守的结构域该酶组成了一个巨大的基因家族,在植物不同的生长发育阶段及其不同的生理过程中,通过作用于细胞壁而发挥作用。已有的研究发现,果胶甲酯酶参与了多种生理过程,如果实成熟、器官脱落、小孢子发育和花粉管伸长、种子萌发、抗病性、形成层细胞分化等。本试验在研究洋葱育性相关基因差异表达的过程中,发现了一个大小约为350 bp的差异表达片段始终只在可育材料中出现,克隆了其编码序列。蛋白质序列比对显示,该基因表达的蛋白具有果胶甲酯酶结构域,属于果胶甲酯酶超家族成员。本研究以洋葱育性恢复系12-10(S,MsMs)为研究材料,利用基因克隆、序列分析、原核表达、生物活性分析及基因枪技术转化洋葱表皮等方法,从分子生物学实验层面初步证明了洋葱AcPME基因是一个在洋葱花粉发育过程中表达的具有PME蛋白活性的定位于细胞壁或细胞膜的PME蛋白超家族成员。本研究结果如下:(1)以洋葱花蕾为试材,通过RACE实验获得了AcPME基因的表达序列;蛋白同源比对与系统进化分析表明,洋葱PME蛋白与水稻、玉米、高粱等单子叶植物的同源蛋白具有较高的相似性;生物信息学分析表明,AcPME蛋白存在明显的信号肽和跨膜区域(SP/TM)、PMEI结构域和PME结构域,在PME家族分类中属于第一类,即含有一个长N末端前区域(pro-region);AcPME蛋白三维结构模式图显示了该蛋白具有一个明显的凹沟,4个结合位点氨基酸残基(T423、Q453、R565和W567),2个活性位点氨基酸残基(D476和D497)。(2)成功构建了pGEX4T-1-PME和pET24a-PMEI原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行了表达条件的优化,确定了pGEX4T-1-PME表达条件为17 oC,0.3 mM IPTG诱导4 h;pET24a-PMEI蛋白表达条件为37 oC,0.1 mM IPTG诱导4 h。SDS-PAGE电泳检测明确了重组蛋白的存在形式,原核表达蛋白pGEX4T-1-PME为可溶性蛋白,而pET24a-PMEI蛋白则以包涵体形式存在;表达蛋白对应的分子量分别约为61.73 kD和24.67 kD,与目的蛋白预期大小相符。(3)利用GST-tag纯化柱对pGEX4T-1-PME表达产物纯化了目的蛋白,同时利用His-tag纯化柱采用柱上复性的方法纯化了目的蛋白pET24a-PMEI,获得了GST-PME和PMEI-6×His纯化蛋白。(4)生物活性分析表明pGEX4T-1-PME(PME)具有明显的PME活性;pET24a-PMEI(PMEI)能够抑制自身蛋白PME的活性,而不能抑制外源蛋白P5400的活性。(5)利用pUC19载体和Ac GFP(Clontech)绿色荧光蛋白基因,成功构建了pUC19-35S-AcPME-AcGFP亚细胞定位载体,并以pUC19-35S-AcGFP载体为阳性对照,利用基因枪轰击洋葱表皮方法进行亚细胞定位,在荧光显微镜下观察发现AcPME融合蛋白定位于细胞膜或细胞壁中,初步证明了该蛋白是一种作用于细胞膜或细胞壁蛋白。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S633.2

【参考文献】