基于转录组的砂梨果实糖转运相关基因的筛选

发布时间：2020-08-03 10:45

【摘要】：梨的果实是一种具有经济价值的贮藏器官,果实中的糖是质量和感官特性的主要决定因素。糖转运蛋白(sugar transporters,STs)在植物生长发育过程中有着重要的作用,主要介导糖类物质的运转,参与源和库组织之间的碳水化合物的装载和卸载。糖在叶片的叶肉细胞中由光合作用生成,然后通过韧皮部运输到库器官,如果实、种子、根和花。在长距离韧皮部运输后,糖从筛管分子-伴胞复合体(sieve element-companion cell,SE-CC)卸载到凋亡的外周细胞壁基质中,而质外体途径通常与糖转运蛋白偶联以促进糖通过膜的运动。鉴定参与果实糖转运基因并了解其分子调控机制,对提高梨感官品质具有重要意义。本研究以三个砂梨品种‘翠冠’(Pyrus pyrifolia‘Cuiguan’)、‘黄花’(Pyrus pyrifolia‘Huanghua’)及‘圆黄’(Pyrus pyrifolia‘Wonhuwang’)为试材,研究砂梨果实发育过程中的几种主要的可溶性糖含量的积累规律,通过转录组测序技术从分子水平鉴定和筛选砂梨果实糖转运相关的基因,并对筛选的糖转运相关基因使用实时荧光定量PCR验证,同时将糖转运基因的相对表达与糖水平进行相关性分析。主要研究结果如下:1.随着砂梨果实的发育,三个砂梨果实的总糖含量呈上升的趋势。在果实生长初期总糖积累速率较慢,到果实生长中期总糖的积累速率最快,而在果实生长后期总糖的积累速率又减缓。成熟的果实在组成总糖的四种类型的糖中,果糖含量最高,其次为葡萄糖和山梨醇,蔗糖的含量最低。2.三个砂梨品种的果实发育过程中,几种主要的可溶性糖的积累规律存在差异。三个砂梨品种果实中的山梨醇在果实发育早期迅速积累,果实发育中期积累速率有所减缓,到果实发育后期积累速率又稍有提高;三个砂梨品种中葡萄糖和果糖的积累规律相似,果实发育早期的积累速度较慢,中期积累速率明显加快,后期积累速率呈缓慢趋势,而‘翠冠’的果糖积累规律相比其他两个品种有所差异,在中期积累速率加快,后期积累速率达到最快;三个砂梨品种的蔗糖积累规律一致,果实发育的前中期积累速率较慢,在果实发育后期积累速率达到最快。3.通过转录组测序技术,共得到每个文库含3.95×10~7~4.61×10~7个、大小为150 bp左右的双端短序列(原始短序列);通过软件对原始短序列过滤,每个文库获得高质量短序列3.52×10~7~4.19×10~7个;高质量短序列被比对到梨参考基因组,最终获得42196个转录本,占模型基因总数的98.58%。基于转录组数据,通过进化树聚类分析,共鉴定出118个糖转运蛋白(STs),包括7个蔗糖转运蛋白(sucrose/H~+cotransporters或sucrose transporters,SUCs或SUTs),19个糖外排转运蛋白(sugars will eventually be exported transporters,SWEETs),92个单糖转运蛋白(monosaccharide transporters,MSTs)。4.通过对高表达的糖转运蛋白的表达谱分析,在‘翠冠’的果实中表达总共30个ST基因,并且它们的表达谱可以分成三个主要簇。群集A由1个SWEET和9个MST组成,随着果实的发育和成熟逐渐上调。具有1个SWEET和5个MST的群集B在所有果实发育阶段被下调,而群集C包括3个SUC和11个MST从花后25 d上调至花后55d,随后随着果实发育而下调。在‘圆黄’的果实中表达了32个ST,显示出两个主要的表达簇;群集A具有2个SUC,1个SWEET和9个MST,当果实成熟时表现出上调的表达,群集B由2个SUC,1个SWEET和17个MST组成,在果实发育期间下调。在‘黄花’中表达了32个ST,表现出两个主要簇。具有2个SUC,1个SWEET和12个MST的群集A显示出果实发育的上调表达,而含有2个SUC和15个MST的群集B在果实发育期间下调。结合三个砂梨品种的表达谱,三个砂梨品种共有的高表达量基因有3个SUC和23个MST。用qRT-PCR验证筛选出11个基因,所有ST基因都显示出与转录组数据相似的趋势。除Pbr031281.1外的所有ST基因均具有显著相关性(r5.0)。5.通过糖转运基因表达与糖水平的相关性分析,我们发现有10个基因的相对表达量与可溶性糖(山梨醇、果糖、葡萄糖和蔗糖)的含量显著相关。表明这些基因在糖的转运中发挥着重要的作用,负责糖的转入或转出。这些ST基因可被认为是参与山梨醇,蔗糖,己糖或戊糖转运及其在砂梨果实中积累相关的的重要候选基因。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S661.2
【图文】：

路径图,路径,果实,山梨醇

西南大学硕士学位论文糖中，果糖的含量最高，葡萄糖含量次之，而山梨醇和蔗糖品种之间，果实内的葡萄糖和果糖含量相对稳定，而山梨醇度比较大，进而形成了梨果实不同糖酸风味[37,47]。从淀粉的将前期看作是以积累淀粉为主，在果实生长后期则是由淀粉，是果实中糖含量的变化重要影响因素[48-49]。从果实的生长实生长初期，幼果期的果实内部细胞分裂分化旺盛，需要通糖和山梨醇等分解单糖和磷酸化的葡萄糖合成相关的底物并理活动正常进行。果实膨大期，细胞分裂分化减缓，主要是重迅速增加[50]，在这一时期多种可溶性糖不断积累，多储0-51]。在果实成熟期，果实中主要可溶性糖的含量达到最高，含量最高，其次为葡萄糖和蔗糖[52-53]。内糖的运输

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图 1-2 梨果实细胞中糖代谢途径(陈俊伟等，2004[31])Fig.1-2 Pathway of sugar metabolism in pear fruit cell（Chen et al.,2004[31]）形式通过山梨醇转运蛋白跨膜进入库细胞，一部分储存在液泡中，另一部分分解为果糖或葡萄糖。而在果实中，山梨醇的代谢途径中受多种酶的参与和，其主要可以分为山梨醇合成酶类和山梨醇氧化酶类。山梨醇合成酶类主要梨醇-6-磷酸脱氢酶（sorbitol-6-phosphate dehydrogenase，S6PDH），葡萄糖-6酸在 S6PDH 的催化下可以转化成山梨醇-6-磷酸，然后在磷酸酯酶（phosphorase）的作用下不可逆生成山梨醇。山梨醇氧化酶类主要包含山梨醇脱氢酶（+-sorbitol dehydrogenase，NAD+-SDH 和 NADP+-sorbitol dehydrogenase，NADDH）和山梨醇氧化酶（sorbital oxidase，SOX），其中 NAD+-SDH 催化山梨醇糖之间的相互转化的可逆反应，NADP+-SDH 催化山梨醇和葡萄糖之间的相互的可逆反应，SOX 则可以催化山梨醇和氧气的不可逆反应生成葡萄糖。蔗糖代谢相关的关键酶主要分为三类：蔗糖合成酶（sucrose synthase ，S化酶（invertase，Ivr）（分为酸性转化酶（acid invertase，AI）和中性转化酶

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速分离纯化吹干，用 1.5 mL 双蒸水溶解壁上的果渣，经过 0.22 μm 的水化移入进样瓶，待高效液相色谱进行检测。3 个砂梨品种的每个时期样品。PLC 条件溶性糖测定方法使用 HPLC 高效液相色谱法进行，色谱条件参考 Koma方法进行。色谱条件：以乙腈：水=8:2 为流动相，流速为 1.2 mL·min-1脱，柱温为 40 ℃，以氮气为载气，40 P 流速，漂移管温度为 65 ℃。验数据处理过标准品定性并绘制标准曲线，并计算每个样品的峰面积，最后定量转克鲜重样品所含可溶性糖的毫克数（mg/g FW）。使用 EXCEL 2007 9.0 软件进行数据处理和差异显著性分析。果与分析梨果实中的山梨醇的积累

【参考文献】