秀珍菇与榆黄蘑原生质体融合育种技术研究

发布时间：2020-08-04 19:54

【摘要】：本文对秀珍菇与金顶侧耳同属之间的原生质体融合育种进行了研究,目的在于筛选出具有双亲优良性状的侧耳属优势新种菌株,丰富侧耳属种质资源。主要研究内容及结果如下:对比秀珍菇和榆黄蘑在不同培养基上的生长情况。拟选取秀珍菇188和平顶榆黄蘑为原生质体融合育种的亲本材料。本试验从菌龄、酶浓度、酶解时间、酶解温度、稳渗液种类及浓度、再生培养基种类、融合剂浓度、原生质体再生方式、原生质体再生培养基类型等方面进行研究,采用单因素试验和正交试验,优化了原生质体制备、再生及融合的最佳条件。结果表明:最终确定的X188-1原生质体制备的最佳条件:菌龄为8天、稳渗液为0.6 mol/L甘露醇和10 mmol/LTris-HCl的混合稳渗液,酶浓度1.6%,酶解时间160 min,酶解温度29℃。在此条件下,原生质体产量达到3.4×107CFU/mL,原生质体再生率达到1.5%。PY-1原生质体制备的最佳条件:菌龄为8天、稳渗液为0.6mol/L甘露醇和10mmol/LTris-HCl的混合稳渗液,酶浓度1.6%,酶解时间160min,酶解温度29 ℃。在此条件下,原生质体产量达到4.7×107CFU/mL,原生质体再生率达到1.7%。在不同酸性条件下对双亲菌丝体生长速度进行测定,结果表明:pH3条件下两亲本菌株生长状况有巨大差异,将pH3作为原生质体融合育种的自然遗传标记之一。采取单亲灭活的方式进行融合育种,将X188-1单核菌株灭活后与PY-1单核菌株融合,然后在PH3的条件下筛选融合子。观察不同灭活处理下原生质体的再生涂布结果,筛选原生质体热灭活的最佳温度和时间。结果表明:65℃水浴25 min作为灭活条件既可达到完全灭活,又能保证原生质体不至于损伤太严重,且热灭活效果稳定,重复性强。观察原生质体间的融合情况和原生质体的存活情况,筛选出最佳浓度和聚合度的PEG融合剂,结果表明:在35%PEG4000促融条件下,原生质体融合率最高,且原生质体受损程度较小。通过对原生质体融合过程的观察,证明了原生质体融合的可行性。本试验以高温灭活和pH筛选为初筛标记,再通过镜检锁状联合获得一株融合子,经纯化后获得一株遗传性状稳定的融合子菌株R1。拮抗试验表明融合子与双亲存在一定的遗传差异,经ISSR分子标记技术证明融合子含有双亲遗传物质。
【学位授予单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S646
【图文】：

长速度很慢，原因可能是松木屑难以分解利用，菌丝生长速度低至一个最小限度。逡逑２．３．３秀珍菇与平顶榆黄蘑在对照组上的出菇图片逡逑由图１观察可知，秀珍菇五个品种之间在外观上存在较大差异。平顶榆黄蘑ＰＹ子逡逑实体伞盖呈现金黄色，秀珍菇子实体伞盖呈现不同程度的灰色。出菇试验结果显示，秀逡逑珍菇与榆黄蘑子实体在外观和颜色上性状稳定，且这两种食用菌之间有较大差异，可以逡逑作为一个很好的原生质体融合亲本材料。逡逑Ａ逦Ｂ逦Ｃ逡逑费逦＂逡逑ｎ逦…＇逦＇．＂Ｖ逡逑Ｖ’逦＼逡逑Ｄ逦Ｅ逦参逦Ｆ逡逑？邋：逦．逦…Ｉ遽逡逑．ｌｉＢｅａ，逦－逦Ｘｔ＇＇＇逦－逡逑二一邋．．．．逡逑图１中Ａ－Ｆ分别为秀珍菇１８、秀珍菇１８８、秀珍菇１６３、秀珍菇１９５、秀珍菇７０５、平顶榆黄蘑ＰＹ逡逑在对照组培养料上的出菇照片。逡逑Ｉｎ邋Ｆｉｇ．邋１，Ａ－Ｆ邋ａｒｅ邋ｔｈｅ邋ｐｉｃｔｕｒｅｓ邋ｏｆ邋ＸＩ８，邋ＸＩ８８，邋Ｘ１６３？邋ＸＩ９５，邋Ｘ７０５，邋ＰＹ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｍｅｄｉｕｍ邋ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．逡逑－１２邋－逡逑

图３菌丝体菌龄对原生质体制备及再生影响逡逑Ｆｉｇ．邋３邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｆｕｎｇｕｓ邋ａｇｅ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ逡逑３酶解液浓度对原生质体制备及再生影响逡逑酶浓度从０．４邋％增大到１．２邋％时，原生质体产量迅速增加。酶浓度由丨．２邋％时，原生质体产量增加速度变缓，原因是酶的效用值达到一个最高点。随度继续提升，原生质体产量开始降低，原生质休的完整性逐渐被破坏，伴随的活力下降，原生质体再生率也下降。所以，最佳酶浓度应控制在１．６邋％。逡逑一？一闱生鹿体产里原生质沐再生军逡逑４－．逦ｒ邋１．６逡逑ｉ３５＿逦－１４逡逑２－ｏｓ

３．３．１０原生质体萌发逡逑原生质体在液体培养的条件下容易萌发且容易观察，将原生质体液体培养２邋ｄ时取逡逑１０邋ｐＬ，用荧光增白剂染色，荧光显微镜观察，结果见图９。逡逑■逡逑■岕逡逑图９中Ａ为原生质体萌发图片（放大倍数Ｋ）Ｘ４０），Ｂ为原生质体萌发（放大倍数１２Ｘ１００）时图逡逑片，Ｃ、Ｄ、Ｅ为（放大倍数１２Ｘ１００）时对应的红蓝绿通道荧光图片逡逑Ｆｉｇ．邋９邋Ａ邋ｉｓ邋ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ邋（ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋１０邋ｘ邋４０）邋ｉｍａｇｅ邋ｏｆ邋ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ，邋Ｂ邋ｉｓ邋ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ邋（１２邋ｘ邋ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ逡逑１００）邋ｉｍａｇｅ邋ｏｆ邋ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ，邋Ｃ，邋Ｄ，邋Ｅ邋ｉｓ邋（ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋１２ｘ１００）邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ邋ｉｍａｇｅｓ邋ｗｉｔｈ邋ｒｅｄ，邋ｂｌｕｅ邋ａｎｄ邋ｇｒｅｅｎ逡逑ｃｈａｎｎｅｌ邋ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ逡逑－２６－逡逑

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本文编号：2781015