大白菜BrPPR基因的耐逆研究

发布时间：2020-08-13 08:58

【摘要】：土壤盐碱化是限制植物生长发育和产量形成的重要因素,是提高我国耕地生产效率的主要障碍之一。土壤日益严重的盐碱化可对植物的生长发育造成离子毒害、渗透胁迫、氧化胁迫及高pH胁迫,筛选对盐碱具有耐受性的作物品种是减少土壤盐碱化导致产量损失的主要策略之一。大白菜是叶菜类中单位种植面积产量最高的蔬菜,富含丰富的维生素,是秋冬季最受欢迎的菜品。分离鉴定抗逆基因、进行大白菜耐逆育种,是今后有效利用盐渍化土壤的主要途径。大量研究表明,植物中的PPR基因可响应盐、干旱和ABA等多种逆境胁迫,但有关大白菜中PPR基因耐逆功能研究尚未见报道。本文以大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)的BrPPR基因为研究对象,利用野生型和BrPPR过表达拟南芥株系为实验材料,对BrPPR基因的功能及耐碱等机制进行了探索,所得研究结果如下:1.BrPPR基因功能分析本实验室早期从大白菜pol CMS恢复系中克隆、鉴定到一个对育性恢复过程十分重要的PPR基因(BrPPR),其蛋白产物定位在线粒体。通过生物信息学分析发现,BrPPR基因长1953 bp,不含任何内含子,编码一个含有650个氨基酸的PPR蛋白,由15个串联的PPR基序构成的P亚类PPR蛋白,该基因与油菜PPR基因的同源性最高。启动子分析显示,BrPPR启动子区的HSE、LTR、MBS、TGA元件分别与热、低温、干旱和生长素胁迫的响应有关。该基因的表达模式分析表明,其受碱和H2O2胁迫的诱导,随处理时间的延长,BrPPR基因在两种逆境处理后的表达水平呈现先升高后降低。该基因的拟南芥过表达系对高pH、NaHCO3和H2O2胁迫均表现抗性,例如种子提前萌发,萌发率提高,子叶提前张开,地上部分增大,根长增长,侧根数增多等,而对照中二者无明显差异。50 mM NaHCO3 土壤种植的拟南芥过表达系植株的成活率比野生型明显提高。ROS染色实验表明,过表达系在碱和H2O2胁迫下积累更少的ROS,细胞内H2O2和氧化胁迫产物MDA的含量也显著低于野生型,表明过表达系中所受到的氧化胁迫有所减弱;进一步分析发现,过表达系中与ROS合成、清除和信号转导通路相关基因的表达水平也比野生型低;对ROS清除相关抗氧化酶SOD、POD、CAT和APX的活性也均低于野生型。添加GST处理可以消除过表达拟南芥与野生型本身积累的ROS及各种逆境下新产生ROS的差别,使其表型趋于一致。综合以上结果表明:BrPP/R基因可能通过减少ROS生成和积累来调节细胞内的氧化还原平衡,从而介导对碱胁迫的抗性。2.BrPPR作用机制分析线粒体是活性氧产生的重要场所之一,而电子传递链复合体I(NADH脱氢酶复合体)是其生成的主要部位,我们通过RT-RCR和qRT-PCR技术对复合体I的各亚基转录物及其剪接情况进行了测定,NaHC03和高pH处理分别导致野生型中nad2亚基第四个内含子和nad7第四个内含子剪接效率的下降;过表达系中nad2、nad7第四个内含子剪接效率则明显增强,而在正常条件下,野生型与过表达拟南芥中两者并无明显差异。对复合体I中NADH脱氢酶的活性进行了检测,结果显示,胁迫处理后过表达系中该酶活性显著高于野生型。在正常情况下,若细胞色素C途径的电子传递因故受阻,则交替氧化酶途径将会补偿性提高。我们测定了在碱胁迫下过表达系中AOX基因的表达明显弱于野生型,说明过表达系的细胞色素C途径的电子传递途径效率高于野生型;碱胁迫对野生型电子传递链的破坏更严重,从而使其被动上调AOX基因的活性。总之BrPPR基因可能通过促进电子传递链复合体I的剪接来维持线粒体电子传递的正常进行,减少ROS的产生,表现出耐碱性。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S634.1
【图文】：

逦｜逡逑Ｏｌｉｇｏｍｙｃｉｎ逡逑图１－１．氋等植物线粒体呼吸电子传递链（ＲａｇｈａｖｅｎｄｒａａｎｄＰａｄｍａｓｒｅｅ，２００３）逡逑Ｆｉｇ．邋１－１．邋Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ邋ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ邋ｅｌｅｃｔｒｏｎ邋ｔｒａｎｓｐｏｒｔ邋ｃｈａｉｎ邋ｉｎ邋ｈｉｇｈｅｒ邋ｐｌａｎｔｓ邋（Ｒａｇｈａｖｅｎｄｒａ逡逑ａｎｄ邋Ｐａｄｍａｓｒｅｅ，邋２００３）逡逑细胞色素氧化酶途径的成分对氰化物敏感，电子传递容易被阻断，此外，逡逑还存在另一条电子传递链逦交替氧化酶途径（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ邋ｏｘｉｄａｓｅ，ＡＯＸ），该逡逑途径为植物细胞所特有，并能抗除氰化物的影响。ＡＯＸ位于线粒体内膜，并朝逡逑向细胞质基质一侧，当细胞色素途径被阻断，还原态辅酶Ｑ携带的电子的传递逡逑方向发生改变，ＡＯＸ直接接受４个２⒔郹埃不乖

本文编号：2791789