燕子花IlMYB306基因克隆及其抗逆功能初探

发布时间：2020-08-15 17:21

【摘要】：本研究为国家自然基金项目(31670344)及中央高校创新项目(2572016EAJ6)的主要研究内容。燕子花作为北方的一种抗寒性较强的水生花卉,具有很高的观赏价值。目前,有关燕子花抗寒等抗性分子方面的研究很少涉及。MYBs基因家族不仅参与了植物的次生代谢反应,而且在响应外界非生物胁迫方面同样发挥了巨大作用。本研究以燕子花为主要研究对象,在已有的转录组数据的基础上,分析了燕子花MYBs基因家族,筛选并克隆了抗性基因IlMYB306,进行了生物信息学分析,检测了 IlMYB306基因在非生物胁迫下的表达情况;同时遗传转化到模式植物烟草中,并对其表达特性进行了初步研究。主要研究成果如下:1.通过燕子花转录组数据,共获得53条MYB转录因子序列。根据结构域类型进行分类,其中6条属于1R/4R型亚家族,3条属于3R型亚家族,20条属于R2R3型亚家族,24条属于MYB相关蛋白。燕子花MYB基因的序列保守程度很高,与同一亚族的MYB基因保守序列一致。亚细胞定位预测显示,50条燕子花MYB蛋白作用于细胞核,c37880.graph_c0定位于细胞膜和细胞核,c42108.graph_c2定位于叶绿体和细胞核,c45677.graph_c0定位于细胞膜和叶绿体。通过MEME在线软件分析R2R3-MYB蛋白序列的基序组成,鉴定出了 5个模体。将燕子花和拟南芥的R2R3-MYB转录因子做系统比较发现燕子花的R2R3-MYB转录因子不仅参与了植物对非生物胁迫响应,还参与了花青素合成等其他的次生代谢过程。最终筛选出非生物胁迫相关的R2R3-MYB转录因子并将其命名为IlMYB306。2.以燕子花的cDNA为模板,通过PCR扩增获得目的基因IlMYB306。该基因全长1024bp,ORF为906bp,编码301个氨基酸。生物信息学分析结果显示I1MYB306的分子量为33.54kDa,理论等电点为6.51,属于不稳定亲水蛋白;存在两个保守结构域,亚细胞定位预测在细胞核中;无跨膜结构,不存在信号肽序列;含有5个糖基化位点,3个潜在的丝氨酸磷酸化位点,8个潜在的苏氨酸磷酸化位点,5个潜在的酪氨酸磷酸化位点;蛋白二级结构显示I1MYB306由37.54%的α-螺旋、5.56%的折叠延伸、3.32%的β-转角和53.49%的无规则卷曲构成,蛋白三级结构预测与二级结构相符。通过与NCBI数据库中的不同物种的MYB306蛋白做同源性分析,发现其与天门冬科芦笋的MYB306蛋白具有较高的同源性,同源性高达99%,推测该基因除具有转录调控功能外,在响应非生物胁迫、参与细胞分化、参与脱落酸和茉莉酸的信号传导等方面也发挥同样作用。3.QRT-PCR检测了燕子花幼苗在受到低温(4℃)及盐(NaCl)和干旱(PEG)不同程度胁迫诱导时IlMYB306基因在幼苗根和叶中的表达情况,结果显示在3种胁迫下燕子花IlMYB306基因的表达量与对照组相比均有变化,充分证明该基因参与了燕子花的逆境响应,并且IlMYB306基因在根中的表达量比叶要高。在冷胁迫下IlMYB306基因呈上调表达,且整体表达量高于干旱和盐胁迫表达量;在初期干旱胁迫下的表达量上升最快,但是随着胁迫时间的增长,该基因的表达量呈下调趋势;盐胁迫下,该基因在叶片中呈下调表达,在胁迫初期根中的表达量增加倍数较低且随着胁迫加剧呈现出下调趋势。可以认为IlMYB306基因具有抗寒功能,推测其响应干旱及盐胁迫。4.构建pBI121-IlMYB306-GFP植物表达载体,利用农杆菌介导法将其转入野生型烟草,通过Kana抗性筛选和PCR鉴定,获得了转基因烟草幼苗。通过实时荧光定量对目的基因在转基因烟草中的表达量的检测,证明了转基因烟草中外源基因的表达量明显高于野生型。对转IlMYB306基因烟草进行原生质体的提取,利用激光共聚焦显微镜进行观察发现I1MYB306蛋白作用于细胞核中。
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S682.32
【图文】：

序列,燕子,转录因子,模体

雀媝＿】瞧逡逑Ｎ逦Ｃ逡逑图２－２燕子花Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ转录因子的Ｒ２Ｒ３保守结构域序列标签逡逑Ｆｉｇ．２－２邋Ｔｈｅ邋Ｒ２Ｒ３邋ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ邋ｄｏｍａｉｎ邋ｌｏｇｏ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ邋ＴＦｓ邋ｉｎ邋Ｉ．邋ｌａｅｖｉｇａｔａ逡逑２．３．４燕子花Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ转录因子的模体分析逡逑ＭＹＢ转录因子中存在很多的保守序列，这些保守序列可能与ＤＮＡ的某些部位相结逡逑合，从而在表达调控中发挥作用［＿。为了深入研究燕子花Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ转录因子中潜在逡逑的保守基序，我们在系统研究了燕子花Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ转录因子进化关系的基础上，通过逡逑ＭＥＭＥ在线分析软件对Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ编码蛋白的基序组成进行了分析，结果如图２－３和逡逑图２－４所示：共鉴定出了邋５个模体，模体１是ＭＹＢ蛋白的Ｎ端结构域，几乎存在于所逡逑有的燕子花Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ中。相对于Ｎ端来说，Ｃ端的模体易变性较高，序列各不相逡逑同，这些特异性的基序预示着不同亚族可能具有不同的功能［１（）２］。根据Ｒ２Ｒ３－ＭＹＢ转录逡逑因子的保守基序种类和在进化树中的分布位置

序列,燕子

３－２所示，条带大小约为ｌＯＯＯｂｐ左右。测序结果显示克隆出的目的片段序列与转录组数逡逑据中的序列完全一致，由此可证明目的基因已被成功克隆。该基因ＯＲＦ为９０６ｂｐ，编码逡逑３０１个氨基酸，其核苷酸和氨基酸对应表如图３－３所示。逡逑Ｍａｋｅｒ邋Ｌｅａｆ邋Ｒｏｏｔ逡逑桯y以s{：；漏逡逑媝：＿灥＾逡逑ｐｉ｜ｌ；；ｖ，：；：：：逦－：：邋，ｖ：：：；？；５：？邋：邋■邋ｖ：，邋■■■．邋．；邋＾｜｜ｉ｜逡逑２0Ｍ邋ＨＭ逡逑ｉｏｏｏＭ＾，：－￣邋ａ邋ｉｌ逡逑７５０邋Ｉ邋’逡逑５00逦…．．二，、ｓ逡逑２５０逡逑１００邋，逡逑图３－２目的基因的扩增反应逡逑Ｆｉｇ．邋３－２邋Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｒｅａｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｐｕｒｐｏｓｅ邋ｇｅｎｅ逡逑２２逡逑

序列,燕子,转录组,氨基酸

２８ｓｌ逦ｉ邋１逡逑ｉ８ｓ｜逦１逦ｍ逡逑ｍ逡逑图３－１燕子花总ＲＮＡ逡逑Ｆｉｇ．邋３－１邋Ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋ｏｆ邋／．邋ｌａｅｖｉｇａｔａ逡逑３．３．２目的基因的ｐｃｒ扩增逡逑以燕子花的ｃＤＮＡ为模板，用特异性引物／／Ｍ７５３０６－Ｆ和进行ＰＣＲ扩逡逑增，退火温度为６５°Ｃ，反应结束后将ＰＣＲ产物用１％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图逡逑３－２所示，条带大小约为ｌＯＯＯｂｐ左右。测序结果显示克隆出的目的片段序列与转录组数逡逑据中的序列完全一致，由此可证明目的基因已被成功克隆。该基因ＯＲＦ为９０６ｂｐ，编码逡逑３０１个氨基酸，其核苷酸和氨基酸对应表如图３－３所示。逡逑Ｍａｋｅｒ邋Ｌｅａｆ邋Ｒｏｏｔ逡逑桯y以s{：；漏逡逑媝：＿灥＾逡逑ｐｉ｜ｌ；；ｖ，：；：：：逦－：：邋，ｖ：：：；？；５：？邋：邋■邋ｖ：，邋■■■．邋．；邋＾｜｜ｉ｜逡逑２0Ｍ邋ＨＭ逡逑ｉｏｏｏＭ＾

【参考文献】