脱落酸及相关激素调控梨芽休眠的分子机制研究

发布时间：2020-08-22 08:08

【摘要】：梨是我国第三大果树,栽培面积与产量均仅次于苹果和柑橘。梨在冬季存在芽休眠现象,芽休眠表现为可见生长的暂停,是包括落叶果树在内的多年生木本植物特有的生理现象,能使植物免于低温伤害,安全度过寒冬。根据引起芽休眠的因素不同将其分为类休眠、内休眠和生态休眠。处于内休眠状态的果树,即使处于适合生长的环境条件下也不能萌芽,必须经过一定时长的低温积累才能度过内休眠,恢复生长能力。内休眠解除后,依然处于生长抑制状态,待气温逐渐回升,外界环境条件适合后恢复生长。当果树进入内休眠状态后,如果冬季低温积累量不能达到需冷量最低要求,树体将无法正常度过内休眠,次年将会出现开花不整齐,花朵育性下降等现象,最终影响果实生产,因此探明芽休眠的调控机制对果树产业发展具有重要意义。本论文通过转录组分析发现休眠过程中激素相关基因变化显著,特别是ABA信号转导相关基因,接下来研究了'酥梨'花芽休眠过程中ABA含量变化及外源ABA处理离体枝条的效应来探究其在休眠过程中的作用,进一步检测了 ABA下游基因CBF对DAM的调控,另外,发现油菜素甾醇(BR)可能在ABA上游起作用,部分阐明了 ABA及相关激素调控梨芽休眠的分子机制。主要结果如下:1)选取休眠不同阶段'酥梨'花芽进行二代测序,混样后进行三代测序。用二代测序结果对三代结果进行校正后,将三代结果与梨基因组进行比对,得到34,996个转录本,其中21,799个为已知转录本的可变剪接形式,另外鉴定到的基因每个有1.89个剪接体,显著高于基因组。二代测序结果比对数据库后,筛选到差异表达基因16,448个,通过mfuzz聚类分析,筛选到20个植物激素信号转导相关的基因,其中11个为ABA信号通路相关基因,推测ABA可能是调控梨芽休眠进程的重要因子。因此我们检测了休眠过程中'酥梨'花芽ABA含量,发现其含量在内休眠开始阶段上升,内休眠阶段一直处于较高水平,之后随着内休眠的解除,ABA含量逐渐降低。在类休眠到内休眠阶段,ABA合成关键基因PpNCED-2和PpNCED-3高表达,而在这个过程中ABA代谢相关基因PpCYP707As表达较低。然而,随着内休眠的推进,PpCYP707A-3在低温积累过程中表达迅速升高,与此同时,ABA含量降低,萌芽率迅速增加。PpPYLs、PpPP2Cs、PpSnRK2s和PpABI4/PpABI5s也随ABA含量变化而变化。另外,外源ABA处理类休眠梨花芽可以显著降低其萌芽率,促进内休眠诱导。在整个处理过程中ABA处理组的PpPP2C-12表达显著低于对照组,而PpSnRK2-1、PpSnRK2-4和PpABI5-1的表达高于对照组。我们的结果表明PpCYP707A-3和PpNCEDs可能在调控内休眠诱导、维持和解除过程中发挥重要作用,同时ABA信号转导通路也在此过程中发挥一定作用。2)由于CBF位于ABA下游,CBF又可以转录调控DAM基因的表达。为研究ABA是否通过CBF来调控休眠进程,我们在高需冷量品种'圆黄'中鉴定得到了 4个PpCBF和3个PpDAM基因,并且检测了他们在自然休眠和人工低温处理条件下的表达模式。在自然休眠过程中PpDAM1的表达在低温积累开始就持续下调,而另外两个DAM和三个CBF基因在内休眠解除过程中达到表达高峰;在低温处理过程中PpDAM1、PpDAM2和PpCBF1的表达趋势与自然条件下的相似。不同的生化试验结果都表明PpCBF2/4可结合PpDAM1的启动子并激活其表达,PpCBFl/4可激活PpDAM3。有趣的是我们发现PpCBF2可以通过直接结合PpCBF3/4启动子来激活他们的表达。结合课题组的其他试验结果,发现ABA可以通过CBF间接激活DAM基因的表达,同时我们鉴定到了调控内休眠的CBF和DAM基因主要为PpCBF1和PpDAM2。3)以'酥梨'为研究材料,利用高效液相色谱串联质谱(HPLC-MS-MS)的方法分析了其自然休眠过程中BR含量的变化,由于BR含量较低,最后只鉴定到香蒲甾醇,其在休眠过程中变化不大。之后,我们通过实时定量PCR的方法研究了 BR相关基因在休眠过程中的表达情况,发现了一些差异表达的基因,这些基因可能在休眠调控过程中发挥一定的作用。通过对不同休眠阶段枝条施加外源油菜素内酯发现,当梨芽有一定的低温积累,油菜素内酯可以部分弥补低温积累量的不足,说明其具有作为破眠剂的潜在应用价值。最后,我们研究了油菜素内酯处理枝条中BR/GA/ABA相关基因的表达模式,发现油菜素内酯处理可以抑制ABA合成基因NCED的表达,同时促进ABA降解基因CYP707A的表达;另外,油菜素内酯处理枝条中GA合成基因GA20ox上调,GA降解基因GA2ox下调,说明BR可能是通过平衡ABA与GA之间的含量来促进破眠。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S661.2
【图文】：

分布情况,分布情况,测序

．２．２．１三代测序数据情况汇总及数据质控逡逑本研究中，我们在ＰａｃＢｉｏ平台上测序了邋１个样本，在总共８个ＳＭＲＴ邋ｃｅｌｌ逡逑（长度分别为１－２邋Ｋ、２－３邋Ｋ、３－６邋Ｋ）的测序中得到８８６，１６５，６０７邋ｂｐ的原始数据逡逑（３３６，１７３邋ｒｅａｄｓ），不同ｃｅｌｌ中平均读长均在合适范围内，并且质量均大于０．９８，逡逑满足测序要求，详细的汇总信息见表２．２和图２．２。逡逑表２．２测序愫况汇总表逡逑Ｔａｂｌｅ邋２．２邋Ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ｓｕｍｍａｒｙ逡逑Ｌｉｂｒａｒｙ邋Ｃｅｌｌ邋Ｒｅａｄｓ邋ｏｆ邋Ｒｅａｄ邋Ｂａｓｅｓ邋Ｍｅａｎ邋Ｒｅａｄ邋Ｌｅｎｇｔｈ邋ｏｆ邋Ｍｅａｎ邋Ｒｅａｄ逡逑Ｎｕｍｂｅｒ邋Ｉｎｓｅｒｔ邋ｏｆ邋Ｉｎｓｅｒｔ（ｂｐ）逦Ｉｎｓｅｒｔ（ｂｐ）逦Ｑｕａｌｉｔｙ邋ｏｆ邋Ｉｎｓｅｒｔ逡逑１－２邋Ｋ逦３逦１４４，３７１＂＂＂２６６，８５７，７１７逦１，８４８逦０９９逡逑２－３邋Ｋ逦３逦１２５，７２１逦３６３，０６８，５７０逦２，８８８逦０．９９逡逑３－６邋Ｋ逦２逦６６，０８１逦２５６，２３９，３２０逦３，８７８逦０．９８逡逑逦ＨＭｎｇｗｗｔｅｔｌｌｅａｄｉＯｔｌｎＭｒｔＣｔｏＭＢｒ逦邋逦ＨｉＭｏｙｎ邋ｌｏｒ邋ＣＸ邋ｔｍｃｒｔ邋ＯｍＷｙ逦邋逦逦Ｈｔａｔｏｉｍｎ邋？ａ？邋Ｏｔ邋Ｉｒａｗｌ邋ＱｍＷｙ逦逡逑￣

分类图,转录本,分类图,可变剪接

逦２８５６逡逑■逦■逦２３２５逡逑Ｍｌｉｉｌ逡逑１逦２逦３逦４逦５逦＞５逡逑Ｍｅａｎ邋Ｎｕｍｂｅｒ邋ｏｌ邋Ｉｓｏｆｏｒｍ邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋Ｆｒｏｍ邋Ｅａｃｈ邋Ｇｅｎｅ逡逑图２．３基因及ｉｓｏｆｏｒｍｓ鉴定图逡逑Ｆｉｇ．邋２．３邋Ｆｉｇｕｒｅ邋ｏｆ邋Ｇｅｎｅ－Ｉｓｏｆｏｒｍｓ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ逡逑２．２．３转录本分类逡逑本研究中，各样本中总共我们共鉴定到了邋１０２０１个已知的转录本，占总转逡逑录本数的２８％，２１７９９个已知转录本的可变剪接形式，占总转录本数的５９．５％，逡逑２９５０个新转录本，占总转录本数的８．１％。转录本分类中各类的比例见图２．４。逡逑Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ逡逑ｋｎｏｗｎ邋ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ逡逑■逦ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ邋ｓｐｌｉｃｉｎｇ逡逑■逦ｎｏｖｅｌ邋ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ逡逑＾邋２８％逦？邋ｏｔｈｅｒ邋ｔｙｐｅ逡逑５９．９％逦８邋１％逡逑图２．４转录本分类图逡逑Ｆｉｇ．邋２．４邋Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ逡逑２．２．４可变剪接逡逑通过可变剪接分析，各样本中我们鉴定到２１７９９个可变剪接转录本。可变逡逑２４逡逑

分布图,分布图,转录本,编码能力

剪接分为四种类型：可变转录起始位点（Ａ５’），可变转录终止位点（Ａ３’），内含逡逑子保留ＯＲ），外显子跳跃（ＳＥ）。三代测序结果中的ＩＲ数量显著高于参考基因逡逑组，其他三种类型数量相近（图２．５）。逡逑逦Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ邋Ｓｐｌｉｃｉｎｇ邋Ｅｖｅｎｔ邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋Ａｎａｌｙｓｉｓ逦逡逑１５０００逡逑Ｉ逦｜逡逑ＩＵ邋１００００逦：邋．：■邋Ｃｌａｓｓ逡逑Ｑ邋ＩｓｏＳｅｑ逡逑ｍ邋Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ逡逑＇ｉＬｌＬＪ逡逑Ａ３＇逦Ａ５１逦ＩＲ逦ＳＥ逦Ｔｏｔａｌ逡逑Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ邋Ｓｐｌｉｃｉｎｇ邋Ｅｖｅｎｔ邋Ｔｙｐｅ逡逑图２．５可交努接事件分布图逡逑Ｆｉｇ．邋２．５邋Ｆｉｇｕｒｅ邋ｏｆ邋ｓｐｌｉｃｉｎｇ邋ｅｖｅｎｔ邋ｔｙｐｅｓ逡逑２．２．５新转录本编码能力预测逡逑在本研究中，各样本中我们鉴定到３２３７７个新转录本，其中２９４２７个为逡逑ｕｎｍａｐｐｅｄ或者低ｍａｐｐｉｎｇ邋ｃｏｖｅｒａｇｅ的转录本，２３邋０４个为鉴定为基因间区的序列，逡逑６４６个为反义链转录本。通过ＣＰＣ，ＣＰＡＴ，ＰＬＥＫ三款预测软件，我们检测到２３５２１逡逑个新转录本具有编码能力，９２２９个转录本为ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ邋ＲＮＡ，预测结果中至少逡逑满足两种方法支持的才能确定为ｃｏｄｉｎｇ或者ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ转录本（图２．６）。逡逑Ａ邋ＣＰＡＴ逦ＣＰＣ邋Ｂ邋ＣＰＡＴ逦ＣＰＣ逡逑１＊５６逦２８１６逡逑２６７逦２１Ｍ逦３ｔＣ？逦９９０逡逑＿逦脚逡逑ｔｆＯ逦３Ｍ４逦２１Ｍ逦２６７逡逑３＞１６逦ＩＭＳ逡逑ＰＬＥＫ逦ＰＬＥＫ逡逑Ｃｏｄｉｎｇ逦Ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ逡逑２５逡逑

【参考文献】