拮抗菌的筛选及对桃果实褐腐病的防治效果研究

发布时间：2020-08-28 05:55

【摘要】：桃果实肉质鲜美、营养丰富,但因对腐烂病菌的高敏感性,使其在室温下质量迅速恶化,采后寿命较短。其中,由褐腐菌(Monilinia fructicola)引起的褐腐病是桃果实采后的重要侵染病害。目前桃果实采后褐腐病的控制主要依赖化学杀菌剂,但长期使用化学杀菌剂会导致病原菌抗药性产生、药剂残留量增加和环境污染等问题。生物防治因其安全无毒、高效无残留等特点在采后病害控制领域的研究成为热点,拮抗菌被认为是生物防治中非常有前途的可替代化学杀菌剂的新途径。有关桃褐腐菌生防菌的筛选及对桃褐腐病的防治报道越来越多,但利用拮抗微生物产生的挥发性成分来抑制病原菌生长和控制采后病害的研究报道比较少见。因此研究拮抗菌挥发性代谢产物对桃褐腐病的生物防治作用有重要的意义。本研究旨在通过一系列试验筛选出对桃褐腐菌有较强抑制作用的拮抗菌,研究其抑制机理和防治效果,确定其挥发性代谢产物主要的活性气体成分,并研究拮抗菌与杀菌剂结合使用对桃褐腐病的防治效果,以期为桃褐腐病的防治提供新的拮抗菌株资源,为其实际应用奠定理论基础,其主要结果如下:(1)采用稀释分离法从桃园土壤中分离出57种细菌,以桃褐腐菌(M.fructicola)为靶菌,采用平板对峙法筛选出对病原菌有较强拮抗作用的菌株12a、14b、15k和16d,其中12a和14b的抑制效果最佳,抑制率分别为70.6%和56.5%。经菌株形态、生理生化特性及16S rRNA基因序列分析进行菌株鉴定,菌株12a和14b分别鉴定为死谷芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)和高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)。(2)通过离体和活体实验对拮抗菌株12a和14b抑菌活性进行了研究,离体和活体实验结果表明,12a和14b的无菌发酵滤液和挥发性代谢产物对桃褐腐菌的生长有很强的抑制作用,其中12a挥发性代谢产物对桃褐腐菌菌丝生长的抑制率达到了83.1%,抑菌效果显著(p0.05)。透射电镜图片显示,经两株拮抗菌的挥发性代谢产物处理的桃褐腐菌菌丝细胞结构被破坏,出现空腔等问题。两株拮抗菌的菌液浸泡和熏蒸桃果实与对照相比,延缓了发病时间,有效地控制了病斑的扩展。(3)通过GC-MS测定挥发性气体主要有酮、酸、烷、醇、酯、酚类等物质。试验测定了挥发性单物质对病原菌菌丝的抑制作用,结果表明异戊基丙酮(6-Methyl-2-heptanone)、2-戊基呋喃(2-Pentylfuran)、甲基丙烯酸异癸酯(Isodecyl methacrylate)和雪松醇(Cedrol)对病原菌有较强的抑制作用。四种挥发性成分混合液的平板试验结果表明,50μL/L的混合液对桃褐腐菌的抑制率达到59.3%,100μL/L时已基本能完全抑制病原菌的生长。(4)通过筛选能与拮抗菌结合使用的杀菌剂,考察桃褐腐菌对杀菌剂的敏感性,继而在果实上验证结合处理对桃果实褐腐病的防治效果。离体试验的研究结果表明,咪鲜胺、咯菌腈和低剂量的甲基硫菌灵对拮抗菌12a和14b生长无抑制作用;桃褐腐菌对三种杀菌剂敏感性不同,但EC_(50)值均小于建议剂量的1%。果实活体实验的研究结果表明,拮抗菌结合低剂量的甲基硫菌灵、咪鲜胺和咯菌腈对桃果实褐腐病的防治效果均好于拮抗菌和低剂量杀菌剂单独处理。(5)通过平板对峙法检测了拮抗菌12a和14b对甘薯长喙壳菌(Ceratocystis fimbriata)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、香蕉盘长孢(Gloeosporium musarum)和苹果腐烂病菌(Valsa mali)的广谱抑菌作用,结果表明菌株12a对上述病原真菌都具有高效的抑制作用,抑制率高于60%;14b的抑制效果相对较弱。活体实验结果表明,两株菌的发酵液浸泡可以较好的防治香蕉炭疽病、草莓灰霉病、甘薯黑斑病和苹果腐烂病,说明两株菌有广谱的抑菌作用和潜在的生防价值。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S476;S436.621.13
【图文】：

褐腐菌,拮抗作用,菌株,拮抗菌

法从桃树根际土壤中分离出 57 株菌，利用平板对峙法较为明显的拮抗菌（表 1），其中菌株 12a 和 14b 的抑到 52.83 mm 时，处理组菌落直径仅为 15.50 mm 和 2 56.5%，结果见图 1。菌株 15k 和 16d 的抑制率分别为 2此选定抑菌活性较高的拮抗菌株 12a 和 14b 进行后续表 1 四种拮抗菌对桃褐腐菌菌丝生长的抑制效果e1 The inhibitory effect of antibiotic bacteria on the development of M. fruct理褐腐菌菌落直径（mm）抑制率ntrol 52.83±0.76a ——2a 15.50±1.50d 704b 23.00±2.77c 565k 39.83±1.26b 246d 38.33±1.53b 27同小写字母表示差异显著(p<0.05)，表中数据为 3 次重复的平均值，下同

系统发育树,菌株,基因序列

15图 3 基于菌株 12a 的 16S rRNA 基因序列构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain 12a based on 16S rRNA gene sequence图 4 基于菌株 14b 的 16S rRNA 基因序列构建的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of strain 14b based on 16S rRNA gene sequence

系统发育树,菌株,基因序列,琼脂糖凝胶电泳

图 2 PCR 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR product from strain 12a and 14b图 3 基于菌株 12a 的 16S rRNA 基因序列构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain 12a based on 16S rRNA gene sequence

【参考文献】