辣椒疫霉效应分子RxLR19781蛋白结构的解析

发布时间：2020-08-28 06:57

【摘要】：辣椒疫霉是一种重要的植物病原卵菌,侵染寄主广泛,常危害辣椒、番茄、茄子、瓜类等多种农作物。在与寄主互作过程中,辣椒疫霉会分泌大量效应分子干扰植物的防卫反应,促进病原菌的侵染和定殖。研究植物与病原卵菌互作的分子机制,从分子水平上揭示植物的抗病机理,对病害防治有重要意义,而结构为我们理解效应分子与植物互作提供了一个新视角。本实验室在前期研究中发现Rx LR19781是辣椒疫霉的一个效应分子,利用PVX载体和瞬时表达技术发现其能抑制Bax和CRN4诱导的本氏烟细胞死亡,因此选择该蛋白进行结构研究。本研究利用PCR技术克隆效应基因RxLR19781至pET28a表达载体;运用原核表达系统以大肠杆菌Rosetta(DE3)为宿主,利用IPTG诱导蛋白表达;运用亲和层析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析进行纯化;借助坐滴法筛选蛋白晶体;通过X-ray衍射收集数据,解析三维结构。主要研究结果如下:(1)从辣椒疫霉基因组中筛选并成功克隆了RxLR19781基因,Rx LR19781蛋白完全符合Rx LR效应分子的特征:N端1~20个氨基酸是信号肽序列,其后是RxLR-DEER保守区,C端为效应区;(2)构建了RxLR19781的pET28a原核表达载体,通过将蛋白融合His标签,成功将其在大肠杆菌内进行了表达;(3)通过Ni~(2+)亲和层析柱纯化,发现重组载体表达出目的蛋白可溶。Rx LR19781蛋白经Ni~(2+)柱亲和层析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析后,得到了高纯度的且均一性较好的目的蛋白;(4)通过坐滴气象扩散法,采用Hampton结晶试剂盒进行蛋白晶体筛选,得到了高分辨率的Rx LR19781母体和硒代蛋白晶体,并在上海进行了X-ray衍射数据的收集,解析出Rx LR19781的三维结构。本论文的研究结果对了解效应蛋白与寄主植物的互作机制提供了重要的实验数据,对构建新型病害防控策略提供了理论基础。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S436.418
【图文】：

域结构,效应因子

图1-2 RXLR效应因子的WY域结构性保守比对图（Win et al., 2012）Fig. 1-2 Crystal structures of the C-terminal regions of RXLR-type oomycete effectorsematic representations showing the modularity and structures of (a) AVR3a11 (AVR3a4 adopts essentially the samecture), (b) PexRD2 and (c) ATR1. The black bars represent the regions of the protein sequence that were crystallized.-helices of the WY domain in each structure are shown in red and labelled a2, a3 and a4; for AVR3a11 and ATR1 theerminal helix that forms the 4-helix bundle is also shown in red (a1). For clarity, in (b), helices not part of the core WY

信号肽,预测结果,氨基酸

图 3-2 信号肽预测结果Fig 3-2 The predication of RxLR19781 signal peptide 跨膜区预测膜区预测结果（图 3-3）显示，所有氨基酸均在膜外，不存在跨膜区。

辣椒疫霉效应分子RxLR19781蛋白结构的解析

跨膜区预测

【参考文献】