蜡梅萜类合成酶基因CpTPS10和CpTPS14的克隆表达与功能研究

发布时间：2020-08-28 09:34

　　 蜡梅(Chimonanthus praecox L.)为我国著名传统花木,其花香馥郁,盛开于万物凋零的冬季,树姿优美,广泛用于切花、绿植、园林栽培和工业香料生产,有极高的绿化及商业价值。本研究基于前人对有香蜡梅株系H29和无香蜡梅株系SW001不同时期的花香挥发物质测定结果,结合H29和SW001转录组数据分析筛选得到在两种材料中差异表达的萜烯合成酶基因CpTPS10和CpTPS14,结合实时定量表达分析和挥发物质测定结果分析,寻找基因表达量与物质挥发量之间的关系。随后对这两个基因的cDNA、gDNA以及启动子序列进行了克隆,通过生物学分析初步判断二者为倍半萜类基因。通过构建pCAMBIA2300双元载体,转化早花烟草对其进行初步的功能验证,主要成果如下:1、在有香蜡梅H29和无香蜡梅SW001花香挥发物质检测中发现萜烯类物质有显著差异,推测在萜烯代谢途径下游的萜烯合酶基因(TPS)对花香差异有着重要影响。通过对蜡梅H29、SW001两株系转录组库数据分析,确定TPS差异表达基因CpTPS10和CpTPS14。对蜡梅开花发育5个时期的花器官样品做CpTPS10和CpTPS14实时定量表达分析,发现CpTPS10和CpTPS14基因在H29和SW001蜡梅中表达趋势确实有所差异。2、分别克隆得到H29和SW001两个株系蜡梅中的CpTPS10和CpTPS14两个基因的cDNA序列,发现均无差异;构建分子进化树,两个基因均聚类于TPS-a亚家族。3、分别克隆H29和SW001中CpTPS10和CpTPS14基因的gDNA序列发现:CpTPS10的gDNA序列在H29中有7个外显子,6个内含子;而在SW001中无内含子,序列与cDNA序列完全一致。CpTPS14的gDNA序列在H29和SW001中均有6个外显子,5个内含子,二者间有69个碱基的差异和两段分别为14bp和51bp的缺失,两段缺失均在内含子部分。4、分别克隆H29和SW001中CpTPS10和CpTPS14基因的启动子序列发现:CpTPS10启动子在H29和SW001中有26个碱基差异,在H29中特有的顺式反应元件ABRE3a、ABRE4和chs-CMA2a,可能与脱落酸响应和光响应有关。SW001中特有的MBS和O2-site分别为参与干旱诱导的MYB位点和参与玉米醇溶蛋白代谢调控的顺式作用调控因子。CpTPS14启动子在H29和SW001中有5个碱基差异以及一个5bp的片段差异,在启动子顺式响应元件的种类上无差异,SW001较H29多出2个TATA-box。5、构建双元表达载体,采用叶盘法转化烟草植株,获得超量表达CpTPS10、CpTPS14的烟草植株,进行GC-MS香气成分鉴定,发现在CpTPS10的转基因烟草中倍半萜石竹烯和4,5-di-epi-马兜铃烯的含量相较于对照有显著提高,CpTPS14的转基因烟草中单萜芳樟醇和倍半萜4,5-di-epi-马兜铃烯均有显著提升,但芳樟醇含量提升最为显著,为对照的6.8倍。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S685.99
【部分图文】：

图 1.萜类化合物 VOC 合成路径示意图（Natalia Dudareva et al 2012）Fig.1 Schematic Map of VOC Synthesis Path of Terpenoids（Natalia Dudareva et al2012）.2.3 单萜/倍半萜合成酶基因研究进展萜烯合成酶（TPS）是萜烯类物质合成中下游的关键合成酶，由于其数量庞，种类繁多，构成了 TPS 基因家族。根据已知的基因组序列和萜烯合成酶氨酸序列的相似程度，可将植物 TPS 基因家族划分成 TPSa-g，7 个亚家族Bohlmann et al 1998,Dudareva et al 2003）。其中 TPS-c 是最原始的一类萜烯合酶分支，被子植物萜烯合酶主要集中在 TPS-a、TPS-b、TPS-g 中（Chen et al011），参与植物次生代谢的萜烯合酶主要分布于 TPS-a、TPS-b、TPS-d、TPS-g中，被子植物的单萜合酶主要分布在 TPS-b 亚家族，裸子植物的单萜合酶主要布在 TPS-d 亚家族中，TPS-f、TPS-g 这两个亚家族也包含部分的单萜合酶（徐

H29、SW001 基因组量标记； 1：H29 gDNA；2 H 29, SW001 genomicular weight marker; 1:H 29 H29、SW001 蜡梅花朵总 RNA（1：芽期；2：6：芽期；7：露瓣期；8： of the Wintersweet flowNA (1: bud stage;2: petal b 52000b1000b

1X TAE 和 1%1X TBE 琼脂糖凝胶跑胶图片可见基因组 DNA 条带明亮单一显拖带，质量较好（图 2）；总 RNA 的 28S 和 18S 条带明亮、清晰，并且S 的亮度在 18S 条带的两倍以上（图 3），质量合格可用于后续实验。M 1 21Kb图 2 H29、SW001 基因组 DNA 检测M： 1Kb 分子量标记； 1：H29 gDNA；2：SW001 gDNA；Fig 2 H 29, SW001 genomic DNAdetectionM:1Kb molecular weight marker; 1:H 29 gDNA; 2:SW001 gDNA;M 1 2 3 4 5

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本文编号：2807408