‘金坠梨’和‘鸭梨’差异表达蛋白PbTM9SF3的功能研究

发布时间：2020-08-29 11:24

　　梨属于蔷薇科(Rosaceae)配子体自交不亲和性果树,而‘金坠梨’是由自交不亲和的‘鸭梨’芽变而来,是自交亲和性品种。前人研究表明,非S因子的突变导致了‘金坠梨’的自交亲和。但导致‘金坠梨’自交亲和性突变的非S因子及其作用机制均尚未有报道。因此,本研究中以‘鸭梨’和‘金坠梨’为试材,采用蛋白质组学技术,在‘金坠梨’中筛选出了与自交不亲和性相关的基因PbTM9SF3。首先,对PbTM9SF3基因进行了系统的生物信息学分析,同时并采用qRT-PCR技术对其进行了时空表达分析;其次,对PbTM9SF3基因进行了亚细胞定位;最后,通过酵母互作实验验证PbTM9SF3基因的功能,获得了如下研究结果:1.利用iTRAQ技术对‘鸭梨’和‘金坠梨’花粉蛋白进行测序,筛选出489个差异表达蛋白,其中上调表达149个,下调表达340个。生物信息学分析表明,差异表达蛋白主要参与一些代谢途径。从差异表达蛋白中筛选出PbTM9SF3基因,设计引物并在‘金坠梨’中克隆PbTM9SF3基因,其核苷酸序列全长为1782 bp。PbTM9SF3基因别称EMP70,属于一种跨膜超家族蛋白(TM9SF)。经蛋白结构域分析,PbTM9SF3基因含有1个大的非胞质区、9个跨膜区,推测其可能作为一种通道和运输小分子的运输器;由氨基酸序列比对可知,PbTM9SF3基因的序列在进化过程中高度保守;系统进化树分析表明,该基因与基因MdTM9SF3被聚类为一支,氨基酸序列同源性达98%2.实时荧光定量PCR研究发现,PbTM9SF3基因在‘金坠梨’花粉中的表达量远高于其叶片和花柱;在花粉中,‘金坠梨’的表达量远高于‘鸭梨’,表明PbTM9SF3基因与‘金坠梨’自交亲和性的改变有关。3.采用基因枪轰击的方法,将受控于CAMV 35s启动子的携带有GFP报告基因和PbTM9SF3基因的PEZS-NL载体瞬时转化进洋葱内表皮细胞中。在荧光显微镜下发现绿色荧光蛋白(GFP)存在于细胞质膜上,表明该蛋白是一个膜蛋白。4.为了验证PbTM9SF3基因在自交亲和反应中的功能,从‘金坠梨’中克隆PbTM9SF3基因、PbS_(21)-RNase基因和PbS_(34)-RNase基因,采用酵母互作的方法研究PbTM9SF3蛋白与PbS_(21)-RNase蛋白、PbS_(34)-RNase蛋白是否发生互作。试验结果显示,与AD-PbTM9SF3、BD-PbTM9SF3两个质粒共转化的酵母菌不能正常生长,提示PbTM9SF3与两个S-RNase在酵母互作中不互作。
【学位单位】：河北科技师范学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S661.2
【部分图文】：

流程图,实验方法,流程图,花粉

9图 2-1 实验方法流程图Fig.2-1 The flowchart of experimental method基因的 qRT-PCR 验证取及检测温保存的花粉提取‘金坠梨’花粉的总 RNA，用 RNA 提取试剂盒（购自 TIANGEN 公司），具体进行。使用 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测提取的总 RN余的溶液-80℃保存备用。

流程图,标准分析,生物信息,蛋白质组

图 2-2 蛋白质组生物信息标准分析流程图Fig.2-2 Flowchart for proteomic bioinformatics standard analysis结果与分析花粉蛋白质鉴定及定量结果 BCA 蛋白质定量法对‘鸭梨’和‘金坠梨’花粉样品进行定量，其为 30 μg，经 SDS-PAGE 电泳分离后，发现样品蛋白质的条带较为均良好（图 2-3a）。采用 LC-ESI-MS/MS 方法在 1%的阳性结果错误率（very Rate，FDR）过滤的标准下，经质谱分析及 Mascot 查库，共鉴定条多肽片段和 4680 个蛋白，唯一多肽片段 13781 个，多肽片段高达 82-2）。对鉴定得到的 4680 个蛋白依据其相对分子质量进行统计，其白的分子质量为 20～60 ku 和大于 100 ku（图 2-3b）。按照差异蛋白变化倍数 ≥ 1.2，Q-value ≤ 0.05）进行筛选，共获得 489 个差异表达

概况,蛋白,灰点,火山

图 2-3 iTRAQ 鉴定蛋白的概况Fig.2-3 Overview of iTRAQ identification proteina)：样品 SDS-PAGE 电泳图；b)：鉴定蛋白的质量分布图图 2-4 显著差异蛋白火山图Fig.2-4 Volcano of differentially expressed proteins红点为显著上调蛋白，绿点为显著下调蛋白，灰点为无显著变化蛋白。

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