大丽花高温胁迫响应机制的蛋白质组学研究

发布时间：2020-08-31 20:08

　　 大丽花原产于墨西哥高原地区,性喜阳光、凉爽且通风良好环境,而我国南方地区夏季高温潮湿的气候条件严重影响大丽花的正常生长及园林应用。前人研究证明外源水杨酸能够有效提高大丽花耐热性,但对其胁迫响应调控机理尚不清楚。为此,本研究以大丽花‘单瓣黄’品种为材料,采用蛋白质组学方法,分离与鉴定大丽花高温胁迫及外源水杨酸调控响应相关蛋白。利用分子生物学技术,克隆热激蛋白基因,并分析其表达特征,以阐明大丽花高温胁迫响应及外源水杨酸调控的分子机理。本研究取得的主要实验结果如下:1.以大丽花盆栽苗盛花期的花瓣和叶片为材料,应用SDS-PAGE和LC-MS/MS方法,分别从花瓣和叶片中成功分离、鉴定了368个和456个蛋白质。GO分析结果表明:花瓣和叶片在分子功能注释中分别有356个和451个蛋白质有相应的分类号,主要涉及蛋白质的结合活性、催化活性、结构分子活性、转运蛋白活性、电子载体活性及抗氧化活性等分子功能;花瓣和叶片在生物过程注释中分别有360个和448个蛋白质有对应的分类号,主要参与细胞过程、代谢过程、单生物过程、生物调控、应激响应以及定位等生物过程;花瓣和叶片在细胞组分注释中分别有342个和437个蛋白质具有相应的定位,主要位于细胞质、细胞器、细胞膜、大分子复合物、细胞核。2.以盛花期大丽花盆栽苗为材料,于人工气候箱进行35℃高温处理,以25℃常温为对照,利用酚提取法提取大丽花花瓣总蛋白,采用IPG/SDS-PAGE方法,经银染和考染显色分析,共检测到显著差异(2倍以上)表达斑点50个,其中上调表达37个蛋白,下调表达13个蛋白。选择表达量高、且分离清晰的蛋白斑点24个,经MALDI-TOF-MS/MS分析,成功鉴定了19个已知功能蛋白,其中抗性相关蛋白13个,细胞骨架形成蛋白2个,代谢相关蛋白4个。3.对35℃高温胁迫下大丽花花瓣外施SA处理,以喷施清水为对照组,1周后,应用SDS-PAGE、Shotgun-LC/MS方法,从大丽花花瓣4条差异凝胶条带中,分别鉴定得到131、73、123和152个差异蛋白。生物信息学分析发现,主要包括结合活性、催化活性、结构分子活性、转运蛋白活性、电子载体、核酸结合转录因子活性、抗氧化活性等分子功能;分别参与细胞过程、代谢过程、应激响应、单生物过程、生物调控等生物过程;主要分布在细胞器、细胞、细胞膜、大分子复合物、隔膜、细胞链接处、细胞间隙、细胞核等部位。KEGG分析其代谢途径主要涉及光合固碳过程、糖酵解、乙醛酸和二羧酸代谢、氧化磷酸化、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、氮代谢等。4.采用分子生物学及生物信息学技术,从大丽花花瓣中克隆了热激蛋白家族4个基因的c DNA序列,分别命名为DpHSP90、DpHSP70、DpCPN60和DpHSP17。DpHSP90基因的编码区序列为750 bp,编码249个氨基酸残基和1个终止密码子;DpHSP70基因的编码区序列为705 bp,编码234个氨基酸残基和1个终止密码子;DpCPN60编码区序列为1569 bp,编码522个氨基酸残基和一个终止密码子;DpHSP17编码区序列为516 bp,编码171个氨基酸残基和一个终止密码子。同源性分析表明,大丽花等菊科植物中热激蛋白家族成员基因序列相当保守。5.采用实时定量PCR技术,对大丽花热激蛋白基因DpHSP90、DpHSP70、DpCPN60和DpHSP17的表达特征进行了分析。结果表明,四个基因在花瓣中均有表达,并且在高温胁迫下4个基因的差异表达显示相同的倾向,即外施SA组的表达量最高,高温胁迫组表达量次之,常温对照组表达量较低,表明4个热激蛋白属于大丽花高温胁迫响应相关蛋白,外源SA参与了热激响应的调控,可以提高植物的抗逆性,从而缓解高温胁迫对大丽花的伤害。
【学位单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S682.261
【部分图文】：

6图 1.1 植物高温胁迫响应表达途径[50]Fig 1.1 Plant adaptations towards high thermotolerance

Fig 1.2 Expression regulation of HSPs[115].4 研究目的与意义研究主要采用蛋白质组学技术，构建大丽花高温胁迫响应相关蛋白表达丽花花瓣高温胁迫及 SA 调控响应相关蛋白质的差异表达、差异蛋白质的用分子生物学技术，克隆大丽花高温胁迫响应相关基因，分析基因序列化关系、高温胁迫相关基因的表达特征，以便从蛋白质组学水平探讨大胁迫响应及外源水杨酸调控耐热性的分子机制，为观赏植物高温胁迫响供新的生物信息。

温胁迫响应机制的蛋白质组学研究 第三章.2.2 高温胁迫下大丽花花瓣蛋白表达谱的 2-DE 分析集不同温度处理后大丽花花瓣，提取蛋白质进行双向电泳（2-DE），得到了晰、分离效果较好的电泳图谱。图谱显示蛋白质组分主要分布在等电点 PI分子量在 18.4-66.2 kD 的范围内（图 3.2）。根据 2-DE 图谱分析软件 Imager 5.0 的分析结果，蛋白质表达量差异在 2 倍以上的斑点共有 114 个，其中在银染中均表现为 2 倍以上的斑点有 50 个，处理组 DH 相对于对照组 CK 上的有 37 个蛋白斑点，下调表达有 13 个蛋白班点。

本文编号：2809264