RALF信号调控番茄生长发育和低温抗性的功能研究

发布时间：2020-08-31 21:05

　　多肽信号对于细胞间交流具有重要作用,许多多肽作为激素参与了植物各种生长发育过程以及环境响应。快速碱化因子(RALF)就是植物多肽家族中的一类。RALF多肽激素参与了多种生理过程,比如:根系伸长、植物-微生物互作以及花粉发育、授粉受精等。不同物种间RALF基因数量和功能多样,而在番茄(Solanum lycopersicum)中RALF基因的功能尚不清楚。目前对于RALF多肽的研究主要集中在生长发育方面,但在环境胁迫中的作用尚不清楚。本文鉴定了番茄中具有保守结构的RALF基因,利用GUS报告基因研究其转录表达模式,并利用病毒诱导基因沉默技术(VIGS)探究了 RALF在番茄生长发育和低温抗性中的功能。主要研究结果如下:1.鉴定了番茄的RALF基因,发现RALF4基因对于调控根系发育具有重要功能。利用系统进化树分析番茄中SlRALR基因与拟南芥中AtRALF基因的同源性,并且根据RALF的保守结构特点筛选出4个RALF基因。测定了它们在不同器官组织中的表达模式,推测RALF可能参与了不同器官的发育。RALF4主要在茎、叶、花中表达,而在根中表达量远低于其他基因;RALF5主要在根和花中表达,尤其以根中表达最为明显;RALFR主要在根、茎、叶、花中表达;RALF7主要在叶中表达,而在根中表达量和RALF4一样低。利用VIGS技术将RALR4、RALF5、RRAL6、RALF7基因沉默,研究发现,与对照TRV植株相比,RALF4沉默植株生长明显矮化,而RALF5沉默植株生长得到促进,RALF6、RALFR沉默植株则无明显差异。结果表明,尽管RALF4、RALF5、RALF6同源性高,但是其功能出现分化。单独将RALFR沉默植株与TRV植株比较,RALF4沉默植株的根系发育受到严重抑制,而RALFR在根系中表达量却很低,表明RALF4可能在根系的特定发育阶段发挥作用。以上结果表明,RALF5抑制植物生长,而RALF4对于根系的发育具有重要作用。2.明确了RALF4基因在根中的表达模式以及RALF4多肽并不通过影响生长素信号调控侧根发育。发现在低浓度RALF处理下,RALF4对于根伸长的抑制作用不明显,但是其仍具有RALF多肽处理幼苗提高培养基pH的生理活性。在转基因植株pRALF4::GUS中,发现RALF4基因在根中的表达具有特异性,其主要在侧根原基以及侧根的基部表达,表明RALF4可能并不参与主根的发育,而是影响侧根的生长。生长素是根系发育最主要的激素,发现沉默RALF4导致根尖生长素响应增强,生长素合成增加。但外源处理RALF4之后,并没有改变根中生长素的响应。同时,对pRALF4::GUS外源处理NAA,发现生长素虽然能够促进侧根发生但却并不能诱导促进RALF4的表达。利用CRISPR/Cas9技术构建了ralf4缺失突变体,进一步明确了 RALF4在侧根发育中的作用。因此,RALFR缺失导致根系发育受阻,其调控过程可能与生长素信号相互独立。基于RALFR GUS染色的情况,其可能在侧根突破表皮的过程中发挥作用。3.明确了 RALF5对于低温抗性的负调控作用。RALF4、RALF5、RALF6的表达量水平在低温胁迫下先上调后下调;利用VIGS技术沉默RALF4、RRAL5、RALF6三个基因,并对沉默植株进行低温处理,发现目的基因沉默植株抗性较对照TRV植株增强,又以RALF5沉默植株的抗性最好。测定了沉默植株中CBF抗冷途径中CBF1和COR47的基因表达,发现RALF5沉默植株的基因表达水平显著上调且CBF1上调最多;同样RALF5沉默植株ABA含量积累最多,并显著高于对照TRV植株,并且这种积累与ABA合成基因NCED1表达水平的提高相关;已有研究表明,BR信号的转录因子BZR1能够调控CBf1/2基因,从而提高植物低温抗性。RALF5沉默植株中,BR合成基因DET2也明显上调,表明BR也可能参与了低温抗性的过程。以上实验表明RALF5负调控植物低温抗性。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S641.2
【部分图文】：

生长发育,植物,过表达,主根

浙江大学硕士学位论文逦逡逑于发芽的番茄种子，会导致胚根的伸长受到显著停滞。在拟南芥中也观察到类似逡逑现象。过表达兄不仅抑制主根的细胞伸长，而且降低侧根密度。兄４ＬＦ７基逡逑因敲除植株则在主根生长和侧根密度方面，表现出与过表达植株相反的表型。因逡逑此，ＲＡＬＦｓ多肽在根生长发育中发挥关键的调节作用。逡逑（Ａ）逦（Ｂ）逡逑

植物生长发育,信号转导,下胚轴,过表达

逦）逡逑Ｃｅｌｌ邋ｅｔｏｎｇａｔｉｏｎ逡逑图１．１邋ＲＡＬＦ参与的植物中生长发育（Ｍｕｒｐｈｙ邋ｅｔａｌ，邋２０１４）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋ＲＡＬＦ邋ｉｎ邋ｐｌａｎｔ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ａｎｄ邋ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ邋（Ｍｕｑ？ｈｙ邋ｅｔ邋ａｌ，邋２０１４）逡逑ＲＡＬＦ多肽对子叶下胚轴的伸长也存在抑制作用。在多肽ＲＡＬＦｌ存在的情逡逑况下，黑暗中萌发的拟南芥幼苗下胚轴伸长受到抑制。当幼苗重新在正常培养基逡逑上生长时，下胚轴伸长恢复（Ｍｉｎｇｏｓｓｉｅｔａｌ，２０１０）。人工合成的ＲＡＬＦ１９，２２，２３，逡逑２４，邋３１，３３和３４，或过表达Ａｔ／Ｌ４ＬＦ八也对下胚轴伸长具有抑制作用。但是，逡逑ＲＡＬＦ４对下胚轴或主根的细胞伸长没有任何影响（Ｅｖａｎｅｔａｌ，２０１４）。这些观察逡逑－结果有力地支持了邋ＲＡＬＦ抑制拟南芥生长和发育过程中细胞伸长的假设。逡逑与兄４ＬＦ７的过表达相似，／＾Ｚ＜Ｆ２３过表达植株表现出生长减弱、矮化、分枝逡逑增加的表型（Ｂｅｒｇｏｎｃｉｅｔａｌ，２０１４）。值得注意的是，在芸苔素内酯（ＢＲ）存在逡逑的情况下

侧根原基,侧根,发育过程,多肽

逦Ｐｏｌｌｅｎ邋ｔｕｂ＾＾逡逑Ｆｅｍａｌｅ邋ｇａｍｅｔｏｐｈｙｔｅ逡逑图１，２邋ＲＡＬＦ－ＦＥＲ在植物生长发育中的信号转导（Ｃｈｒｉｓｔｉｎａ邋ｅｔａｌ，邋２０１８）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．２邋ＲＡＬＦ－ＦＥＲ－ｍｅｄｉａｔｅｄ邋ｓｉｇｎａｌｉｎｇ邋ｉｎ邋ｐｌａｎｔ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ａｎｄ邋ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ逡逑（Ｃｈｒｉｓｔｉｎａ邋ｅｔ邋ａｌ，邋２０１８）逡逑１．１．４邋ＲＡＬＦ及其受体ＦＥＲ在植物生物和非生物胁迫中的功能逡逑ＲＡＬＦｓ在生物和非生物胁迫中的作用主要依赖于其受体激酶ＦＥＲ实现。而逡逑在不同的胁迫响应中，ＲＡＬＦｓ具有不同的作用以及分子机制。有研究表明，ＦＥＲ逡逑直接参与植物的先天免疫。ＦＥＲ作为支架蛋白能够促进病原体相关分子模式逡逑（ＰＡＭＰ）受体ＦＬＳ２或ＥＦＲ与ＢＡＫ１结合以分别响应ｆｌｇ２２和ｅｌｆｌ８两种ＰＡＭＰ，逡逑从而正调控植物防御。但是处理多肽ＲＡＬＦ２３之后，抑制了邋ＦＬＳ２／ＥＦＲ－ＢＡＫ１复逡逑合体的形成，并阻断了邋ＲＯＳ爆发等免疫反应（Ｓｔｅｇｍａｎｎｅｔａｌ，２０１７）。但是逡逑突变体则对ＲＡＬＦ多肽抑制先天免疫反应不敏感，说明与ＲＡＬＦ１邋—样，成熟逡逑ＲＡＬＦ２３多肽的形成需要经历前体ＲＡＬＦ分泌，以及后续Ｓ１Ｐ加工，切割后的成逡逑熟多肽与ＦＥＲ的胞外域结合

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