珠眉海棠（Malus zumi Mats）中褪黑素合成酶黑暗下的转录调控及其泛素化降解的分子机制

发布时间：2020-09-07 16:18

　　褪黑素(N-乙酰-5-甲氧基色胺)是有效的活性氧清除剂,在逆境响应中发挥重要作用。同时,它也是重要的活性物质,调控植物的生长发育。在植物中,褪黑素合成路径已被初步解析。我们首次从珠眉海棠(Malus zumi Mats)中分离了褪黑素关键合成酶基因MzSNAT5、MzASMT1、MzASMT3及MzASMT9。但褪黑素合成调控的分子机制仍是空白。我们的研究主要围绕调控褪黑素合成的两条主要途径:一是通过“转录调控”,上调合成酶基因的表达,提高合成酶蛋白水平的“开源”模式;二是通过“翻译后调控”,减少褪黑素合成酶的泛素化降解,延长半衰期的“节流”模式。植物中褪黑素的合成受强光和黑暗诱导,因此,我们猜测响应光/暗信号的主要转录因子调控褪黑素合成酶转录,并进行了筛选。在苹果及模式植物拟南芥中发现,KJ可能是调控黑暗下褪黑素合成的关键转录因子。KJ通过直接结合褪黑素关键合成酶基因启动子,抑制其表达和褪黑素合成。此外,本研究分离了 3个与褪黑素合成酶互作的MzWL蛋白,并证实了 WL通过与褪黑素关键合成酶形成复合物,减少合成酶的泛素化降解,保证褪黑素合成。本研究对苹果属植物中褪黑素合成调控机制的揭示,将为分子育种培育高褪黑素含量的转基因苹果提供理论依据。结果如下:1.体外试验表明,褪黑素合成酶MzSNAT5与AtSNAT6、MzASMT3与AtASMT8均能催化褪黑素前体N-乙酰血清素及褪黑素的合成;在体内系统中,超表达AtSNAT6/AtASMT8和异源表达MzSNAT5/MzASMT3的转基因拟南芥,褪黑素含量显著升高,证明它们在植物体内催化褪黑素合成,编码褪黑素合成酶。2.体外EMSA试验证明,MzKJ和AtKJ能分别特异性地结合MzASMT3、AtSNAT6与AtASMT8的启动子。体内ChIP-qPCR试验证明,MzKJ、AtKJ能直接结合MzASMT3、AtSNAT6与AtASMT8的启动子。沉默KJ的转基因苹果愈伤/拟南芥中,合成酶基因表达增加,褪黑素含量明显升高;而超表达KJ使合成酶基因表达下降,褪黑素含量显著减少。表明KJ直接结合褪黑素合成酶基因的启动子,抑制表达,负调控褪黑素合成。3.黑暗诱导了MzASMT3、AtSNAT 与AtASMT8基因的表达,使褪黑素含量明显增加。黑暗下,KJ蛋白水平下降,因此ChIP-qPCR结果显示,它结合的合成酶基因启动子也随之较少。进一步证明,黑暗使KJ水平下降,从而减少对褪黑素合成酶基因表达的抑制,增加植物中褪黑素合成。4.黑暗下,外源褪黑素处理使褪黑素合成酶基因表达上调,体内褪黑素含量明显增加,并抑制拟南芥幼苗子叶开张。而KJ通过调控黑暗下褪黑素的合成,影响子叶开张。5.克隆得到3个MzWL基因。苹果原位BiFC、Co-IP结果证明,这3个MzWL与MzSNAT5、MzASMT1和MzASMT9互作。泛素化检测表明,MzWL与合成酶通过形成复合物,降低合成酶的泛素化降解。综上所述,黑暗下KJ通过减少对关键合成酶基因表达的抑制,增加褪黑素合成,并抑制子叶开张;而WL蛋白通过与关键合成酶互作,减少关键合成酶的泛素化降解,保证褪黑素合成。这是首次在植物中,发现褪黑素合成调控的分子机制。
【学位单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S661.4
【部分图文】：

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最终在Ｎ－乙酰血清素甲氧基转移酶（ＡＳＭＴ）的催化下生成褪黑素。并且，他们发现，在逡逑沉默７３／／的水稻突变体中，色胺会在ＳＮＡＴ的催化下生成Ｎ－乙酰色胺，而过多Ｎ－乙酿色胺的积累逡逑会抑制ＡＳＭＴ的催化活性，从而抑制褪黑累？合成（图１－２）。逡逑（Ｂ）邋ｒ逦邋Ｔｉｐ逡逑：ｔｐｈ逡逑５－（）Ｈ－Ｔｒｐ邋Ｔｒｖｐｔａｍｉｎｅ邋逦逡逑＊邋，逦ＡＡＮＡＴ逡逑扣Ｔ５Ｈ逡逑ＩＴＫ逦ｙ逡逑逦＞逡逑Ｉ逦＾逡逑ＡＡＮＡＴ邋＾逦．＼－ａｃｅｔｙｌｔｒ＞ｐｔａｍｉｎｅ逡逑ａｓｍｔ｜邋ｌ＜逦逡逑图１－２褪黑素在植物体内的合成路径（Ｐａｒｋｅｄ．，邋２０１２ｂ）逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋ｐａｔｈｗａｙ邋ｏｆ邋ｍｅｌａｔｏｎｉｎ邋ｉｎ邋ｐｌａｎｔｓ邋（Ｐａｒｋ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１２ｂ）逡逑ｆｆｕ本实验室也第一次在双子叶植物苹果屮成功分离获得苹果域褪黑素合成酶基因ｒａｃ、ｒ５ｗ、逡逑与ＡＳＭ；Ｔ（ＬｅｉｅＭ／．，２０１３）。进一步的研究发现，咖啡酸氧甲基转移酶（ＣＯＭＴ）也能参与植逡逑物屮褪黑素的合成。血清素能够先在ＡＳＭＴ或Ｃ０ＭＴ的作用下，牛成５－甲l#基色胺（５－ＭＴ），冉逡逑在ＳＮＡＴ作用下，生成褪黑素。因此，植物屮存在多条褪黑素的合成路径，较动物史为复杂。逡逑目前，植物屮褪黑素的合成路径存在多种情况（图１－３）。Ｋ屮，较为常见的是：底物色氨酸经逡逑过“色胺－血清素－Ｎ－乙酰血清素－褪黑素”的传统路径

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１．２．２植物中褪黑素的合成场所逡逑虽然，植物中褪黑素的合成路径己被解析，但植物中褪黑素的合成场所一直到近几年才被发现。逡逑相比于动物，植物细胞中褪黑素的含量氋出许多（Ｔａｎ邋ｅ；ａ／．，邋２０１２），这意味着植物和动物中可能存逡逑在不同的机制来合成褪黑素。Ｋａｎｇ等人（２０１３）发现，比起动物ＳＮＡＴ，水稻ＳＮＡＴ与蓝藻细菌ＳＮＡＴ逡逑在进化上具有更近的亲缘关系。而蓝藻细菌能够合成褪黑素，并在漫长的进化过程中，进化成了后逡逑代叶绿体，因此，研究者推测，叶绿体可能保留了蓝藻细菌合成褪黑素的能力，它可能是植物中褪逡逑黑素合成的重要场所之一■邋（Ｔａｎ邋ｅＺａ／．，２０１３，邋２０１４）。这一■猜测在本实验室（Ｚｈｅｎｇ邋ｅｆ邋ａ／．，邋２０１７ａ）的研逡逑究中被证实。我们发现了，定位于叶绿体中的苹果属褪黑素合成酶ＭｚＡＳＭＴ９，并证明了叶绿体能够逡逑合成褪黑素。这是首次在植物中证明叶绿体是合成褪黑素的主要场所之一。逡逑此外，另一种假说认为，在植物中，线粒体也是合成褪黑素的场所之一。根据内共生理论，线逡逑粒体是由一类ａ变形杆菌进化而来的，例如紫色非硫细菌，它能够合成褪黑素并具有明显的昼夜节逡逑律，这表明线粒体很可能仍保留着其前体细菌合成褪黑素的能力（Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒｅｆａ／．，１９９５；Ｅｓｓｅｒｅｆａ／．，逡逑２００４；邋Ｔａｎ扣《／．，２０１３）。因此，研究者推测，在内共生的过程中，这种细菌进化成线粒体，并且保逡逑留了其中参与褪黑素合成的基因（Ｔａｎ邋ｅ？ａ／．，邋２０１３，邋２０１４）。进一步，我们的研究（Ｗａｎｇ邋ｅｆａ／．，２０１７）逡逑首次在植物中发现，苹果属褪黑素合成酶ＭｚＳＮＡＴ５定位于线粒体中，并首次证明了，在植物中线粒

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论文逦第二章黑暗下ＫＪ对褪黑素合成酶合成酶。我们从拟南芥中克隆得到了机４ＭＳＭ７？基因。Ａ７１邋ｂｐ，编码２５６个氨基酸，分子量为２８．９２邋ｋＤａ，具有乙酰基转移酶开放阅读框为１１２２邋ｂｐ，编码３７３个氨基酸，分子量为４０．９４邋ｋＤａ，）。逡逑０．２５

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