兰科花卉TCP基因生物信息学分析及蝴蝶兰CYC-like基因克隆与功能研究

发布时间：2020-09-07 16:42

　　兰科植物(Orchidaceae)为单子叶植物中最大的一个科,其花形奇特且花色丰富,大部分为两侧对称花且具有1枚高度特化的唇瓣,具有较高的观赏价值和经济价值。蝴蝶兰(Phalaenopsis)是兰科植物中产业化程度最高的兰科观赏植物,其生长周期相对较短,快繁体系也日趋成熟,以蝴蝶兰作为研究材料将有利于对兰科基因功能进行分析。目前关于蝴蝶兰CYC-like基因作用机制研究较少。本研究通过对兰科TCP基因进行生物信息学分析并以蝴蝶兰为试验材料,分离了 3个CYC-like基因并对其进行序列分析及表达特征研究,进一步构建正义表达载体,将PhCYCs分别转化夏堇,并对转基因植株进行性状观察和表达分析,初步确定了其功能,为兰科花卉CYC-like基因功能研究提供了理论依据。主要研究结果如下:1、通过对单双子叶CYC/TB1基因进行比较,发现单双子叶CYC/TB1基因在进化过程中出现功能分化,且单子叶CYC/TB1基因仍保留CYC功能。兰科10个属植物TCP基因的序列比对及系统进化分析结果显示,其TCP基因高度保守,CYC/TB1基因在进化过程中存在复制及分化。对蝴蝶兰TCP基因进行motif分析预测和TCP结合位点分析,发现蝴蝶兰CYC/TB1基因均包含TCP结构域和R结构域,在两者之间还存在假定ECE motif(motif 3),且CYC/TB1基因的启动子区域存在假定CYC结合位点。初步认定蝴蝶兰CYC/TB1基因仍保留CYC基因参与花对称性发育的功能。2、根据小兰屿蝴蝶兰全基因组测序结果,从蝴蝶兰杂交种'火凤凰'中克隆到3个CYC同源基因,分别命名为PhCYC1、PhCYC2和PhCYC3,其中PhCYCl基因开放阅读框(ORF)为867bp,编码288个氨基酸;PhCYC2基因开放阅读框(ORF)为1005bp,编码334个氨基酸;PhCYC3基因开放阅读框(ORF)为975bp,编码324个氨基酸。且PhCYCs与金鱼草的AmCYC(56.20%)以及玉米的ZmTB1(50.38%)具有较高的同源性。系统进化分析显示,PhCYC1、PhCYC2、PhCYC3同源性较高,与兰科植物及其他物种的CYC/TB1基因聚类在同一分支下。3、通过酶切位点分析、质粒双酶切和测序等方法成功构建了正义表达载体pCAMBIA1302-PhCYC1、pCAMBIA1302-PPhCYC2 和 pCAMBIA1302-PhCYC3.亚细胞定位试验结果表明PhCYCs基因定位于细胞内。半定量及荧光定量结果显示,PhCYC1和PhCYC2在各时期蝴蝶兰杂交种花芽中表达基本一致,PhCYC3主要是在早期阶段表达(b1-b2)而在后期(b3-b6)表达下降。在蝴蝶兰杂交种中,PPhCYC2和PhCYC3在所有花器官中表达量均比PhCYC1高。在小兰屿蝴蝶兰中,PEQU_06749(PhCYC2)和PEQU_06750(PhCYC3)在野生型小兰屿蝴蝶兰花瓣中表达高而在三唇瓣突变体的唇瓣状花瓣中基本不表达,且在突变体的唇瓣中也下降明显,而PEQU_11715(PhCYC1)的表达则在突变体中上调,此外PhCYC2和PhCYC3在突变体败育蕊柱中表达上调。CYC-like基因在不同花序分枝类型的蝴蝶兰杂交种荧光定量分析结果显示,PPhCYC2和PhCYC3在不分枝大花型的顶端花序(Ⅰ1),去顶大花型抽出的第一级花序(Ⅰ3),多分枝小花型的顶端花序(Ⅰ4)和小花型第一级侧花序(Ⅰ5)中表达被抑制,在大花型潜伏花序(Ⅰ2)中表达量高,而PhCYC1在Ⅰ1和Ⅰ2中表达低,当大花型蝴蝶兰顶端优势被去除,PhCYC1在去顶大花型抽出的第一级花序(Ⅰ3)中明显提高,且在小花型花序(Ⅰ4和Ⅰ5)中也具有高表达量,结果显示蝴蝶兰PhCYCs同时具有CYC、TB1两方面功能。4、通过农杆菌介导法将蝴蝶兰PhCYCs基因分别转化夏堇,经PCR鉴定获得了转PhCYCs基因夏堇植株。RT-PCR结果表明,蝴蝶兰PhCYCs基因在夏堇中能正常转录,且不同株系内源基因的表达模式不同。转基因结果显示所有转基因株系的分枝均增多且花型发生改变,并且转基因株系变异花型均表现出侧部花瓣属性,初步说明蝴蝶兰PhCYCs基因既参与花型发育又调控分枝过程。
【学位单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S682.31
【部分图文】：

氨基酸序列,氨基酸序列,基因

小兰屿蝴蝶兰基因组中找到的３个ＣＦＣ－ｌｉｋｅ基因ＣＰＥ０Ｃ／ＪＭ７办，和逡逑Ｐ￡０ｉ７＿７ｉ７／５）在内的一些物种的ＣＴＯＴ５／基因部分ＴＣＰ结构域氨基酸序列进行了分逡逑析（图１－１）。序列比对结果显示，所有植物ＴＣＰ结构域中均包含一个保守的Ｌ／ＶｘｘＬＬ逡逑ｍｏｔｉｆ，在核心真双子叶植物ＣＹＣ２分支基因的第一个氨基酸为亮氨酸（Ｌ），而在木兰逡逑类和单子叶植物中，第一个氨基酸发生了改变，大部分为缬氨酸（Ｖ），而这种Ｌ／ＶｘｘＬＬ逡逑ｍｏｔｉｆ被认为参与调节蛋白质互作并且其第一个亮氨酸是决定花冠单对称性建立的关逡逑键氨基酸（Ｈｏｒｎｅｔ邋ａｌ．，邋２０１４）。逡逑表１－１被子植物中ＣＦＣ／７Ｂ７基因比较逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－１邋Ｔｈｅ邋ＣＹＣ／ＴＢ１邋ｇｅｎｅｓ邋ｉｎ邋ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍ逡逑ＣＹＣＩＴＢＩ邋ｉｓ￣￣花对称性相关基因逦表达特征逦参考文献逡逑Ｓｐｅｃｉｅｓ逦ＣＹＣｉＴＢｌ邋ｇｅｎｅｓ邋Ｆｌｏｒａｌ邋ｓｙｍｍｅｔｒｙ逦Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｐａｔｔｅｒｎ逦Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ逡逑逦ｒｅｌａｔｅｄ邋ｇｅｎｅｓ逦逡逑木义类植物逦木本马兜铃逦ＡａｒＣＹＣＵ、２逦ＡａｒＣＹＣＬｌ逦远轴花被片和蘑菇状结构的发逦Ｈｏｍｅｔａｌ．．逡逑ＭａｇｎｏＪｉｉｄｓ逦Ａｒｉｓｔｏｌｏｃｋｉａ邋ａｒｂｏｒｅａ逦疴。逦２０邋Ｍ逡逑（马兜铃科逦Ｔｈｅ邋ａｂａｘｉａｌ邋ｐｅｒｉａｎｔｈ邋ａｎｄ逡逑Ａｒｉｓｔｏｌｏｃｈｉａｃｅａｅ）逦ｍｕｓｈｒｏｏｍ逦ｍｉｍｉｃｒｖ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．逡逑核心Yg双斤脉根逦ＬｊＣＹＣ！＇邋２、３、５逦ＬＪＣＹＣ２逦背部花瓣的会育。逦Ｆｅｎｇｅｔ邋ａｌ．

氨基酸序列,系统进化分析,基因家族,文心兰

逦逦邋ＡＩ９９０９３３０逡逑图１－５文心兰ＴＣＰ基因家族氨基酸序列比对及系统进化分析逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－５邋Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ邋ｏｆ邋ａｍｉｎｏ邋ａｃｉｄｓ邋ａｎｄ邋ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ邋ｏｆ邋Ｏｎｃｉｄｉｕｍ邋ｈｙｂｒｉｄｕｍ邋ＴＣＰ邋ｇｅｎｅｓ邋ｆａｍｉｌｙ逡逑0Ｑｉｇ？Ｑ？１１３０９１逦１邋＇逦ｊｊＴ邋ＫｇＬＨｎｉｇｖｆＴＪＲｖ邋Ｓ邋ＴｊＪ邋Ｉ邋Ｑ｛３Ｙ｛ｊＩｊｒ邋ｒ：邋（ＴＯｙＲｃ邋？邋ｇｉＡ邋ＶＤｇｎｉ邋Ｋ邋ａＪＪｄ邋ａＪＪＩａ邋Ｄ０Ｐ邋Ｅ邋Ｌ逡逑Ｄｎｌｇ？ｎ？９３３６１逦１邋ＨＳ邋！＂Ｕ邋Ｗ邋？邋ｉ邋３Ｖ＊邋ＳｖＳＴＳＩＱ＾邋ｊＴ邋＇Ｓ＂邋ｉｉＡ邋＾ｊｊｌＫＡｊＡＡｊＪ邋ＶｂＨｐＢ－逡逑Ｃ邋ｌａｓｓ邋ＩＩ逦ＰＢＱＵ１９５４７逦１逦Ｊｗｇｖｉ＾Ｌ邋丨．！邋Ｖ：逦ＢｖＳ邋Ｔｊｊｌ邋Ｑ０Ｙ邋ｊ邋Ｒ逦ｒ0ＱＰ逦＆ＶＫ逦ＺＫＡｇＡＯＳ逦ＩｄＱｐＢＬ逡逑ｃｃ？ｔｔｋ＊逦ｎｎｉｇ？ｎ？ｉ７２２４逦ｉ＾＾ＫＢｓＳｌｓＥｌ逦ｖ逦ｌｓｑｐ邋ｖｖｄＡ逦ｉｎａＪｏｈｅ逦ｄｘＨｐｐｌ逡逑Ｄｎｉｇ？ｎ？１０４６？２逦１逦■邋２．．’＿逦ＢＡＨＴＳ邋Ｐ邋Ｉ邋Ｒ邋！切卩邋Ｉ邋Ｉ邋ＡＶＤｔ逦ｉ邋ＩＫＮ！邋ＫＰＳ邋叫私。１＊逡逑Ａｔ３ｇｌ５０邋３０逦１逦Ｊ邋ＵＡ／２：逦Ｊ］Ａ：ｉ邋２邋？

氨基酸序列,蝴蝶兰,基因家族,基因

根据７ＴＰ基因家族各分支保守氨基酸差异分析（Ｍａｒｔｉｎ－ＴｒｉｌｌｏａｎｄＣｕｂａｓ，邋２０１０），逡逑我们从小兰屿蝴蝶兰基因组中成功获得了邋３个ＣＴＣ／Ｔ５／基因，９个Ｃ７Ｗ基因和８个逡逑ＰＣＦ基因（图１－１１Ａ），并通过在线ｍｏｔｉｆ预测网站ＭＥＭＥ（ＢａｉｌｅｙａｎｄＥｌｋａｎ，邋１９９４）分析逡逑其氨基酸序列（图１－１１Ｂ和Ｃ）。逡逑＼逦１邋－邋－ＨＴＰＫｌＪｊＷｉＷＪＩＮＲＰＱ逦阳Ｆ｜ｇｙ邋Ｆｇ＾ｊＬＤｇｊｆｆｌＴＫＳＫＥｇｆｌＫＥｇＶＱＳＫＳＳ邋？逡逑１邋－－ＱＡＶＫ＾＾＾＾：邋ＹｇＳＱ逦＾邋ＪＴｇＬＤ＾ＷＴＫＳＫＴＧ邋ＫＥ｜ＪＶＱＳＫＳＴ－逡逑ｗｒｃｒｉ逦ｌ邋－邋－ｋｖｖｆ？ｕａ邋．邋：ｉ３３３ｊ邋＾ＥＩｇｉＣ邋－１逦ｋａ＾ｍ，ｄ＾ｍｋｋｓｒｋＪ邋ｋｅｖｖｑａｋｎｌ－逡逑Ｃｌａｓｓ邋ＩＩ逦＜ＫＫｔ：．ｒｉ逦１逦ＰＲＴ＾＾＾：逦ｒＳａ；逦ＲＤＯＴ３Ｔ？逦３ｒ逦Ｑｆ逦ＫＡ＾0ｆｔ）＾ｍＴＱＳＫＰｒ逦ＤＲｇＡＡＤＰＳＳ－逡逑？ｖｒ？ＲＩ邋．．．逦／ｒｎｌＢＩ逦１逦－邋－邋ＡＡＡＲ｛＾＾＾２逦ｒｋ＾ａＲ逦３ｈ逦Ｑｆ逦ｋａ＾＾Ｒｑ＾ＱｎｔｓｋｓＳ逦ｑｂｉｍａｄｄａｓ－逡逑ｉ邋？＇邋ｉｍｉ－ｎｋｅ逦Ｐｔｇｉ邋

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