反义PPO转双孢蘑菇的获得及抗褐变特性研究

发布时间：2020-09-18 09:50

　　双孢蘑菇采后易褐变,常温不易贮藏。本课题利用反义RNA技术获得抗褐变双孢蘑菇。将双孢蘑菇PPO反义抑制表达载体与增强表达载体分别以农杆菌介导的遗传转化方法导入As2796双孢蘑菇中,进行栽培出菇试验,成功获得抗褐变耐贮藏的双孢蘑菇材料。主要研究结果如下:1、通过研究农杆菌菌液侵染不同组织块,建立农杆菌介导的双孢蘑菇的高效转基因体系。确定了菌褶是双孢蘑菇农杆菌转化中最为理想的侵染材料,污染率较低为10.3%。通过转化子经出菇试验获得转基因双孢蘑菇子实体,其中菌株Y1-10的产量达15.32 kg/m~2,比对照组增产41.5%,菌株Z5-19、Z5-5、Y1-10具有菇柄短小粗壮、菇盖厚实肥大等优良性状的潜力,Z5-19菇盖厚度可达2.88cm,单菇重量达4.36g。2、通过荧光定量PCR技术对转基因双孢蘑菇AbPPO1、AbPPO3、AbPPO4、AbPPO5基因的mRNA转录水平表达量的测定,发现反义抑制转基因双孢蘑菇PPPO基因表达量有不同程度上的降低,有65%的反义菌株得到了抑制,反义抑制转基因双孢蘑菇对PPO基因抑制表达程度为50%~75%之间。在增强表达转基因双孢蘑菇中,PPO基因在转录水平上得到了不同程度的高表达,有87%的增强表达菌株得到高表达。3、在对转基因双孢蘑菇抗褐变性状研究中通过分析子实体的硬度、菇盖白度、切面褐变发现:增强表达转基因双孢蘑菇在硬度值方面显著优于反义抑制转基因双孢蘑菇和CK,其中增强表达菌株Z-5-5的硬度值最大为4.5N,CK硬度值为2.9N,菌株Z5-5、Z5-19、Z6-9在贮藏5天后菇盖白度值在80~82.5之间依然处于消费者可接受范围内,明显高于对照组CK。并且菇盖白度和硬度值两者具有高度相关性,相关系数值高达0.73,菌株Z5-5、Z5-19、Z6-9所表现出的抗褐变耐贮藏性与其具有高硬度的特性有着密切的联系。
【学位单位】：浙江农林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S646
【部分图文】：

农杆菌,菌液,PCR检测,抗褐变

反义 PPO 转双孢蘑菇的获得及抗褐变特性研究2.4.1 农杆菌检测分析为验证质粒是否成功转入根癌农杆菌中，分别进行农杆菌菌液 PCR 扩增检测，检测结果如图 2.1，扩增条带正确，可以用来进行后续双孢蘑菇子实体遗传转化实验。M antiP1 antiP2 antiP3 antiP4 P5 P62.4 结果分析

图 2.1 农杆菌菌液 PCR 检测Figure 2.1 PCR detection ofAgrobacterium plasmid注: M. DL2000 Marker2.4.2 农杆菌介导双孢蘑菇子实体的遗传转化分析农杆菌转化侵染后的双孢蘑菇外植体，需在含有无菌滤纸的 CM 固体平板培养基上进行共培养 24 h，共培养结束后，在含有 Hyp 30 mg/L、Cef 200 mg/L CM培养基上进行第一次筛选培养；25℃培养 20d 左右菌丝长至 2~3cm 后，选取长势良好的菌丝转移至 Hyp 45 mg/L、Cef 200 mg/L CM 培养基上进行第二次筛选；25℃培养 15~20d 左右菌丝长至 2~3 cm，筛选结束，将长势良好的菌丝转移至空白 CM 培养基上培养，20d 左右，保存菌种。培养结果如图 2-2。

菌丝,PCR检测,转化子

侵染组织块个数污染数污染率（%）（mm/d）菌褶 87 9 10.3 2.3±0.42生长点 76 7 9.2 1.0±0.28菌丝球 81 20 24.7 1.3±0.14农杆转基因双孢蘑菇抗性菌丝筛选过程中，不同筛选阶段，杂菌污染情况也不相同。第一次筛选培养时期的污染情况，主要是农杆菌污染，表现为外植体周围有粘稠状乳白色液体；第二次筛选培养时期的污染情况，主要为农杆菌和霉菌；筛选后在空白培养基的复壮阶段，主要为霉菌污染，主要表现为菌丝周围有绿色、黄色、黑色等分生孢子出现。2.4.3 抗潮霉素阳性转化子鉴定结果用改良 CTAB 法提取转化子的 DNA，使用潮霉素引物对其进行 PCR 扩增引物序列为 Hypf:CCCTTATCTGGGAACTACTC，Hypr: GTTATGTTTATCGGCACT-TT，扩增结果如图 2.3 所示：泳道 1、2、3、5、6、8 为阳性转化子。

【参考文献】