甜瓜CmIAA16和CmGSTU12基因在果实发育中功能的初步分析
发布时间：2020-09-21 19:54
甜瓜是一种具有经济价值的园艺作物,由于其醇香甘甜且营养丰富而深受消费者喜爱,在世界各地广泛栽培。本研究以甜瓜品种河套蜜瓜(Cucumis melo L.cv Hetao)为材料,通过对本实验室已获得的甜瓜果实转录组数据分析,选择果实发育不同时期差异表达基因CmIAA16和CmGSTU12,对其进行了生物信息学分析、克隆、表达谱及遗传转化研究,主要结果如下:(1)通过双向比对法,分别在甜瓜中鉴定得到18个Aux/IAA基因和48个GST基因,分析两个家族基因编码蛋白的分子量、等电点、氨基酸个数等理化性质,得到了该家族成员的染色体定位、基因密度、亚细胞定位、基因结构、保守基序及蛋白系统进化关系的分析预测结果,结果表明CmIAA16基因可能通过参与激素信号通路从而调控激素信号通路下游基因的表达,进而在植物的生长发育过程中发挥作用;而CmGSTU12可能通过参与激素诱导及响应非生物胁迫来发挥作用。(2)采用RT-PCR对目的基因进行了cDNA克隆,得到的ORF长度分别为714 bp和657 bp,构建了其各自的超表达载体和基因编辑载体,命名为:pPIAA16、pPGSTU12、pYL-IAA16和pYL-GSTU12。(3)利用实时荧光定量PCR分析CmIAA16和CmGSTU12基因在果实不同发育时期的表达量,结果显示CmIAA16在生长期果实中表达量最高,CmGSTU12基因在呼吸跃变期果实中表达量最高,与转录组数据相符。(4)采用子房注射法对甜瓜进行遗传转化,获得T_1代转化种子,随机选取60粒饱满种子并对其进行PCR检测。从阳性率高的导入果实中随机选取120粒种子播种于温室,观察果实表型后发现,转化CmIAA16超表达载体的T_1代果实较对照组提前成熟了4.3天,初步表明CmIAA16基因具有促进果实成熟的功能,可能是甜瓜果实成熟过程的正调控因子;转化CmGSTU12超表达载体的T_1代果实较对照组延迟成熟了5.5天,初步表明CmGSTU12基因具有抑制果实成熟的功能,可能是甜瓜果实成熟过程的负调控因子。
【学位单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S652
【部分图文】：
am HI/Kpn I 对测序正确的克隆重组质粒和 pPZP221 空载体分别进行双酶切 DNA 总量 0.5 μg，限制性内切酶各 1 μL，10×Buffer 3 μL，ddH2O 补足至 37℃，2 h。将切好的克隆重组质粒用 1 %琼脂糖凝胶进行电泳，利用 San纯化回收试剂盒对目的片段进行回收，对切好的空载体进行纯化。将目的比为 4∶1 的比例进行连接，反应体系：目的片段 10 μL，pPZP221 载体 x μL，10×T4Buffer 2 μL，ddH2O 补足至 20 μL。反应条件：16℃，过夜连接。杆菌 Trans-T1感受态细胞进行转化，待转化完成后，将菌液涂在含有壮观 LB 固体培养基上，倒置，37℃，过夜培养。挑取大小合适的单个菌落进行，对初步得到的阳性重组质粒进行双酶切验证，反应体系：1 μL Bam HI，1 quick cut Buffer，2 μL 质粒，ddH2O 补足至 10 μL。反应条件：37℃，1 h。脂糖凝胶电泳进行检测，以确保目的片段与载体成功连接且大小正确。将酶克隆质粒分别命名为：pPIAA16 和 pPGSTU12，并将正确的菌株保存备用
图 2.2 sgRNA 表达盒的构建[90] 中间载体与引物接头的连接；B.利用通用引物及靶位点引物 UF/RP 和 FP/gRCR 扩增；C.利用巢式特异性引物进行第二轮 PCR 以获得完整的 sgRNA 表达Figure 2.2 Construction of sgRNA expression cassettes[90]estion/ligation with an sgRNA intermediate plasmid and target adaptor;B. First roune primer sets UF/RP and FP/gR-R,respectively. FP and RP are the adaptor forward a,and UF and gR-R are the universal primers;C. Second PCR using the nested positioprimers(Pps-R/Pgs-L、Pgs-2/Pps-2) to obtain a complete sgRNA expression casset轮 PCR步得到的稀释产物为模板，UF/RP、gR/FP 为引物进行第一轮 PCR，下游引物各 2 μL、5 μL 5×Prime STAR GXL Buffer、2 μL Prime STA2 μL dNTP、补足 ddH2O 至 20 μL。反应程序：98℃ 5min；98℃ 1 s，30 个循环；68℃ 7 min。用 1.0%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行轮 PCR轮 PCR 产物为模板，Pps-R/Pgs-2 或 Pps-2/Pgs-L 为引物，进行第二轮
内蒙古大学硕士学位论文SPR/Cas9 载体的构建 Golden Gate Ligation 方法将 sgRNA 表达盒与 pYLCRISPR/Cas9 载体连接。首对 sgRNA 表达盒与 pYLCRISPR/Cas9 载体进行酶切，再利用 T4连接酶将酶切达盒与 pYLCRISPR/Cas9 载体进行连接。反应程序：37℃ 10 min，10℃ 5 min 个循环；37℃ 3 min，10℃ 5 min，20℃ 5 min，10 个循环。
本文编号：2823926
【学位单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S652
【部分图文】：
am HI/Kpn I 对测序正确的克隆重组质粒和 pPZP221 空载体分别进行双酶切 DNA 总量 0.5 μg，限制性内切酶各 1 μL，10×Buffer 3 μL，ddH2O 补足至 37℃，2 h。将切好的克隆重组质粒用 1 %琼脂糖凝胶进行电泳，利用 San纯化回收试剂盒对目的片段进行回收，对切好的空载体进行纯化。将目的比为 4∶1 的比例进行连接，反应体系：目的片段 10 μL，pPZP221 载体 x μL，10×T4Buffer 2 μL，ddH2O 补足至 20 μL。反应条件：16℃，过夜连接。杆菌 Trans-T1感受态细胞进行转化，待转化完成后，将菌液涂在含有壮观 LB 固体培养基上，倒置，37℃，过夜培养。挑取大小合适的单个菌落进行，对初步得到的阳性重组质粒进行双酶切验证，反应体系：1 μL Bam HI，1 quick cut Buffer，2 μL 质粒，ddH2O 补足至 10 μL。反应条件：37℃，1 h。脂糖凝胶电泳进行检测，以确保目的片段与载体成功连接且大小正确。将酶克隆质粒分别命名为：pPIAA16 和 pPGSTU12，并将正确的菌株保存备用
图 2.2 sgRNA 表达盒的构建[90] 中间载体与引物接头的连接；B.利用通用引物及靶位点引物 UF/RP 和 FP/gRCR 扩增；C.利用巢式特异性引物进行第二轮 PCR 以获得完整的 sgRNA 表达Figure 2.2 Construction of sgRNA expression cassettes[90]estion/ligation with an sgRNA intermediate plasmid and target adaptor;B. First roune primer sets UF/RP and FP/gR-R,respectively. FP and RP are the adaptor forward a,and UF and gR-R are the universal primers;C. Second PCR using the nested positioprimers(Pps-R/Pgs-L、Pgs-2/Pps-2) to obtain a complete sgRNA expression casset轮 PCR步得到的稀释产物为模板，UF/RP、gR/FP 为引物进行第一轮 PCR，下游引物各 2 μL、5 μL 5×Prime STAR GXL Buffer、2 μL Prime STA2 μL dNTP、补足 ddH2O 至 20 μL。反应程序：98℃ 5min；98℃ 1 s，30 个循环；68℃ 7 min。用 1.0%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行轮 PCR轮 PCR 产物为模板，Pps-R/Pgs-2 或 Pps-2/Pgs-L 为引物，进行第二轮
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1 李诗萌;甜瓜CmIAA16和CmGSTU12基因在果实发育中功能的初步分析[D];内蒙古大学;2019年
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