牡丹内源酚类物质与IAA反应产物结构及生理功能解析

发布时间：2020-09-24 21:46

　　本研究以牡丹内源酚类物质和吲哚乙酸(IAA)为原料,在多酚氧化酶(PPO)的作用下,对反应产物进行分离提纯和结构的鉴定。同时,通过对反应产物生理活性的鉴定和与牡丹试管苗不定根发生关系等方面的研究,初步揭示了牡丹试管苗生根过程中内源酚类物质代谢和根系发生的关系。主要研究结果如下:(1)牡丹内源二元酚(绿原酸、咖啡酸和儿茶酚)均可与IAA在PPO的作用下发生反应,产生三种新的物质。即反应24 h后,在5.572 min(产物I)、8.035 min(产物II)和9.045 min(产物III)处出现三个新的色谱峰。通过对三个产物进行分离提纯发现,产物I和产物II的紫外吸收完全一致,均在216和279 nm有紫外吸收峰,且产物I和产物II同时存在,互相转化,说明产物I和产物II互为同分异构体;而产物III在242、260和298 nm有紫外吸收峰。通过液相质谱联用仪发现,产物I在正离子模式下的质荷比[M+H]+m/z:169.0497,且通过红外光谱分析可知,产物I含有苯环结构,核磁共振分析可知,产物I含有甲氧基官能团,综合推测产物I为4,5-二甲氧基-1,2-苯醌。产物III在正离子模式下的质荷比[M+H]+m/z:146.1128,熔点在195-198℃之间,且通过核磁共振和热裂解-气质联用分析可知,产物III为吲哚-3-甲醛。(2)通过产物和IAA的生理活性比较发现,不同浓度产物I在24 h和48 h对小麦芽鞘伸长量和对照差异不显著,表明产物I促进小麦芽鞘伸长的作用不明显;不同浓度产物I对绿豆插条生根率的影响差异不显著,整体高于对照,但生根率最大值仍出现在IAA的处理中,表明产物I对绿豆插条生根有一定的促进作用,但低于IAA。不同浓度产物III处理小麦48 h后,浓度为10~(-1)和10~-22 mmol·L~(-1)的处理小麦芽鞘的伸长量与对照差异显著,但整体低于IAA处理,表明产物III促进小麦芽鞘伸长的作用显著,但低于IAA;产物III浓度为10~(-2)和10~-33 mmol·L~(-1)的处理绿豆下胚轴生根率最高,显著高于对照,但与IAA10~-44 mmol·L~(-1)的处理差异不显著,表明产物III促进绿豆插条生根的作用高于IAA,但二者无显著差异。综上表明,促进伸长的能力:IAA产物III产物I,促进生根的能力:产物IIIIAA产物I。(3)在培养基中添加不同浓度产物进行生根培养后发现,随着产物I浓度的升高,牡丹试管苗生根率先升高后降低,且在浓度为3 mg·L~(-1)时达到最大值26.92%,显著低于IAA 3mg·L~(-1)处理;随着产物III浓度的升高,生根率也逐渐提高,且在产物III的浓度为4 mg·L~(-1)时,生根率达最大值,但与IAA处理无显著差异。对生根期间酶活性进行测定发现,不同处理间差异较大,其中POD活性在0-5 d的变化趋势整体一致,根原基诱导期(3-5 d)波动较大,产物III和IAA处理均在第3 d POD活性达到最大值,且产物III高于IAA处理;在PPO活性方面,各处理间的变化趋势差异不大,同样IAA和产物III处理在第3 d达到峰值,且产物III处理活性更高,而此时对照的活性处于最低值;IAAO活性整体在较小的范围内波动,在根原基诱导期(3-5 d)产物I、III和IAA处理活性整体都处于下降趋势,且产物III处理下活性最低。(4)采用超高效液相色谱-串联四级杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)对植物内源玉米素(ZT)、赤霉素(GA_3)、吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)、吲哚丁酸(IBA)和水杨酸(SA)6种激素进行检测方法的考察和建立,研究表明6种激素的保留时间分别为ZT:0.51 min、GA_3:2.12 min、IAA:2.71 min、ABA:3.03 min、IBA:3.70 min和SA:4.74 min,5 min之内可完成检测且分离效果较好。通过对流动相中不同甲酸(FA)浓度进行研究发现(0‰、0.1‰、0.2‰、0.5‰和1‰),ZT随着FA浓度的升高,响应逐渐降低;GA_3、IAA、ABA和IBA均在0.1‰FA响应最高;SA在0.5‰FA响应最高,故流动相中加入0.1‰FA最适合6种激素的检测。通过对牡丹试管苗生根期间内源激素含量变化进行研究时发现,在根原基诱导期(3-5 d)茎基部内源IAA的含量处于升高趋势,玉米素(ZT)在0-10 d茎基部含量一直处于下降趋势,赤霉素(GA_3)在根原基诱导期处于上下波动趋势,脱落酸(ABA)在0-5 d茎基部含量处于下降趋势,且含量极低,5-25 d处于升高趋势。通过免疫荧光定位法发现,IAA在三个部位均以维管束的分布最多,且在茎基部一直作用于根原基形成的部位,信号的强弱与其含量相一致。(5)通过代谢组学的方法对牡丹试管苗根系发生关键期的内源代谢物进行提取时发现,在正离子模式下最多可以提取到4752个离子峰,而负离子模式下最多可以提取到4740个离子峰;牡丹试管苗根原基形成期的代谢物主要分布在0.5-2 min、4-7 min和10-14 min之间。通过主成分分析(PCA)发现,生根培养3 d后牡丹试管苗内源代谢物并未发生较大波动,生根培养5 d后内源代谢物差异明显,且培养天数和激素处理均区分明显,初步推测牡丹试管苗在根原基形成期(3-5 d)内源代谢物变化与根系发生密切相关。综上可知,三种二元酚与IAA在PPO的催化下,均可发生反应,产生三种同样的物质;结合核磁共振、红外光谱及质谱表明,推测产物I为4,5-二甲氧基-1,2-苯醌,与产物II互为同分异构体;产物III为吲哚-3-甲醛。产物I的生长素活性不明显,对绿豆不定根的发生有一定促进作用,但低于IAA;产物III具有显著的生长素活性,但活性低于IAA,对绿豆不定根发生的促进作用显著,且高于IAA。添加适宜浓度的产物I对牡丹试管苗的生根有一定促进作用,但生根率显著低于IAA处理,推测反应生成的4,5-二甲氧基-1,2-苯醌可能是生根的一种辅助因子;添加产物III能显著促进牡丹试管苗的生根率,生根率高于IAA处理,但二者差异不显著。初步推测在PPO的作用下牡丹体内的二元酚与IAA发生反应,使部分IAA转化为吲哚-3-甲醛,此物质亦具有生长素活性,能促进根系发生,但IAAO不能对其进行氧化,从而在根原基诱导期对IAA的含量起到一定的保护作用,维持体内生长素类物质的水平,进而促进根原基的诱导。
【学位单位】：河南农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S685.11
【部分图文】：

色谱,产物,子离子

产物 III 质谱表征产物III进行质谱分析时发现，产物III在[M+H]+和[M-H]-模式下的一级质荷比]+m/z：146.0502（图 3-6-A）和[M-H]-m/z：144.0460（图 3-7-A）；从二级离子模式下的主要子离子为 91.0352、118.0385（图 3-6-B），负离子下的主要429、144.0457（图 3-7-B）。产物 III 真空热裂解-气质联用（PY-GC-MS）表征样品在真空环境下进行热裂解分析可知，产物 III 在气相中的色谱出峰时间3-7-A），通过与气质自带的 NIST 数据库匹配发现，推测该化合物为吲哚-3-甲主离子峰为：m/z 144.06，子离子峰为：m/z 89.07 和 116.06，与核磁图结果吻甲醛的标准品进行质谱进样比对发现其一级和二级质谱图完全一致。在 HPL进样发现，出峰时间与紫外吸收与产物 III 完全一致（图 3-8-A；图 3-8-B）间及紫外吸收完全一致。

-A产物III的1H-NMRFig.3-5-AThe1H-NMRfigureofproductIII

-B产物III的13C-NMR图

【参考文献】