芍药种子萌发关键基因PlCYP707As的克隆及植物表达载体构建

发布时间：2020-09-29 22:28

　　芍药为芍药科芍药属多年生的宿根草本花卉,是我国古老的名花。其观赏价值可以与花王牡丹相媲美,有花相之称,在园林造景中普遍应用。长时间的系统进化形成了芍药种子独特的上下胚轴双重休眠的特征,给芍药新品种的选育工作带来很大困难,对芍药的产业化发展十分不利。本研究是以芍药父本'粉玉楼',母本'粉玉奴'的杂交种子为试验材料,选取萌发过程中四个关键时期的种子为样品进行转录组测序,筛选出调控芍药种子萌发的关键基因PlCYP707A1和PlCYP707A2,分析基因表达模式,克隆基因cDNA全长并进行生物信息学分析及植物表达载体构建,为后续转化拟南芥的转基因功能验证奠定基础。主要的试验结果如下:1.分析转录组数据,锁定了脱落酸分解代谢途径中的调控基因PlCYP707A1和PlCYP707A2为目标基因。以转录组测序所得CDS序列为基础,设计定量引物,通过半定量RT-PCR和实时定量PCR技术分析PlCFP707A1和PlCYP707A2基因的表达量,结果显示PlCYP707A1基因在吸胀后和下胚轴萌发时表达量有明显升高,PlCYP70742基因在芍药种子萌发过程中含量逐渐增加。总体来说,在芍药种子萌发过程中PlCYP707A1和PlCYP707A2基因的表达量升高,对打破休眠起到了促进作用。2.以转录组测序所得CDS序列为基础,设计同源克隆引物,PCR扩增后获得cDNA全长1407bp,编码468个氨基酸的PlCYP707A1基因和cDNA全长1392bp,编码463个氨基酸的PlCYP707A2基因。同时以PlCYP707A1和PlCYP707A2基因的cDNA序列为信息探针,搜索GenBank的基因组或表达序列数据库,获得不同物种间的同源基因氨基酸序列,构建进化树。利用各种在线软件对PlCYP707A1和PlCYP707A2基因的蛋白质的一级、二级、三级结构和亚细胞初步定位等进行了预测分析。3.利用pBI121植物载体和DNA重组技术构建了 PlCYP707A1和PlCYP707A2基因的表达载体pBI-PlCYP707A1和pBI-PlCYP707A2,接着将其转化到GV3101型农杆菌制备的感受态中,为后续基因转化拟南芥做功能验证奠定基础。
【学位单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S682.12;Q943.2
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章文献综述
    1.1 芍药概述
    1.2 种子休眠机理的研究进展
        1.2.1 影响种子休眠的因素
        1.2.2 植物激素GA对种子休眠解除的调控作用
        1.2.3 植物激素ABA对种子休眠解除的调控作用
        1.2.4 其他植物激素对种子休眠解除的调控作用
    1.3 ABA在休眠萌发过程中的相关调控基因
    1.4 ABA 8'-羟化酶(CYP707As基因)的研究进展
        1.4.1 ABA8'-羟化酶的作用机理
        1.4.2 CYP707As基因(ABA 8'-羟化酶)的表达模式
    1.5 植物表达载体构建的研究进展
    1.6 本研究的目的意义与技术路线
        1.6.1 本研究的目的意义
        1.6.2 本研究的技术路线和内容
第二章 PlCYP707A1和PlCYP707A2基因的表达模式分析
    2.1 试验材料
    2.2 试验试剂与仪器
        2.2.1 试验试剂
        2.2.2 溶液的配制
        2.2.3 试验仪器
    2.3 试验方法
        2.3.1 种子的沙藏催芽
        2.3.2 芍药种子RNA的提取
        2.3.3 RNA质量的检测
        2.3.4 反转录合成cDNA
        2.3.5 半定量RT-PCR分析
        2.3.6 qRT-PCR分析
    2.4 结果与分析
        2.4.1 芍药种子总RNA的提取质量
        2.4.2 芍药种子合成的cDNA电泳检测
        2.4.3 半定量RT-PCR循环次数的确定
        2.4.4 PlCYP707A1和PlCYP707A2基因的半定量RT-PCR分析
        2.4.5 PlCYP707A1和PlCYP707A2基因的qRT-PCR分析
    2.5 小结
第三章 PlCYP707A1和PlCP707A2基因的克隆与生物信息学分析
    3.1 试验材料
    3.2 试验试剂与仪器
        3.2.1 试验试剂
        3.2.2 菌体及载体
        3.2.3 溶液的配制
        3.2.4 试验仪器
    3.3 试验方法
        3.3.1 PlCYP707A1和PlCYP707A2基因的cDNA扩增
        3.3.2 TA克隆
        3.3.3 生物信息学分析工具
    3.4 结果与分析
        3.4.1 PlCYP707A1基因cDNA全长的扩增产物
        3.4.2 PlCYP707A1基因的生物信息学分析
        3.4.3 PlCYP707A2基因cDNA全长的扩增产物
        3.4.4 PlCYP707A2基因的生物信息学分析
    3.5 小结
第四章 PlCYP707A1和PlCYP707A2基因的载体构建及转化
    4.1 试验材料
    4.2 试验试剂与仪器
        4.2.1 试验试剂
        4.2.2 菌体及载体
        4.2.3 溶液的配制
        4.2.4 试验仪器
    4.3 试验方法
        4.3.1 重组质粒PGM-T-CYP707As的提取
        4.3.2 重组质粒PGM-T-CYP707As的双酶切
        4.3.3 载体质粒pBI121的双酶切
        4.3.4 目的基因与载体质粒相连
        4.3.5 植物表达载体转化农杆菌
    4.4 结果与分析
        4.4.1 pBI121-CYP707A1重组载体的菌落PCR鉴定
        4.4.2 pBI121-CYP707A1重组载体的双酶切验证
        4.4.3 pBI121-CYP707A2重组载体的菌落PCR鉴定
        4.4.4 pBI121-CYP707A2重组载体的双酶切验证
        4.4.5 pBI121-CYP707A1/CYP707A2重组农杆菌菌落PCR鉴定
    4.5 小结
第五章结论与讨论
    5.1 结论
        5.1.1 明确PlCYP707A1和PlCYP707A2基因在芍药种子萌发过程中的表达模式
        5.1.2 克隆得到芍药PlCYP707A1和PlCYP707A2基因
        5.1.3 构建PlCYP707A1和PlCYP707A2基因的植物表达载体并转化农杆菌
    5.2 讨论
参考文献
致谢

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