西兰花转录因子BoMYB51的鉴定与功能分析
发布时间：2020-10-11 13:20
芥子油苷是一种富含硫和氮的来源于氨基酸的次生代谢产物,存在于十字花科植物中。根据前体氨基酸的种类不同,可以将芥子油苷分为吲哚族芥子油苷、脂肪族芥子油苷和芳香族芥子油苷。芥子油苷的水解产物具有多样的生物活性。西兰花(又称青花菜)作为一种非常受欢迎的蔬菜,其中巨大的营养价值与抗癌活性物质受到越来越多的关注。西兰花的抗癌活性主要来源于一种脂肪族芥子油苷的次生代谢产物萝卜硫素,最新研究表明某些吲哚族芥子油苷的水解产物也具有抗癌活性,并且在植物抵御病原菌和虫害过程中起到重要的作用。在模式植物拟南芥中,吲哚族芥子油苷的代谢途径已经被研究透彻。有三个转录因子类MYB家族成员在吲哚族芥子油苷的合成调控中起到重要的作用,分别为MYB51、MYB34和MYB122。MYB51主要在地上部分调控吲哚族芥子油苷的合成,MYB34主要负责根中的调控。超量表达MYB51可以增加吲哚族合成基因的表达,从而增加吲哚族芥子油苷的含量。植物通过吲哚族芥子油苷防御病原菌的机理也逐渐被揭示,吲哚族芥子油苷与其降解产物可以触发细胞壁胼胝质的合成,减弱病原菌导致的细胞程序性死亡。近年来,随着其他十字花科植物的基因组测序,芥子油苷通路及其调控因子也逐渐被鉴定,一些芸薹属蔬菜中吲哚族芥子油苷合成基因的表达模式也陆续被报道。然而,在广受欢迎的蔬菜西兰花中,调控吲哚族芥子油苷关键基因MYB51的生理功能和分子特性还是未知。本研究克隆并鉴定了一个西兰花基因MYB51,命名为BoMYB51。通过在拟南芥中超量表达BoMYB51,分析吲哚族芥子油苷代谢通路相关基因的表达以及芥子油苷的含量,检测Flg22(Flagellin22)诱导的胼胝质沉积。通过在拟南芥中表达BoMYB51启动子驱动的GUS(β-glucuronidase)及Real-time PCR技术,分析了BoMYB51的组织表达特性与激素和胁迫下的表达模式,初步揭示BoMYB51的分子特性和可能参与的生理过程。通过本研究,将加深对芸薹属蔬菜吲哚族芥子油苷调控机理的理解,为十字花科吲哚族芥子油苷的研究提供理论数据,为改良抗病西兰花品种奠定理论基础。本研究的主要研究结果如下:(1)BoMYB51的克隆与生物信息学分析根据实验室前期转录组测序数据获得的MYB51参考序列,利用cDNA末端快速扩增技术(Rapid-amplification of cDNA Ends,RACE)克隆西兰花“青秀”品种的MYB51 mRNA全长。MYB51的cDNA全长1641 bp,其中5’端非编码区(Untranslated region,UTR)长度为355 bp,3’端非编码区长度为323 bp,编码区(Coding sequence,CDS)长度为963 bp,可编码320个氨基酸,我们将其命名为BoMYB51(基因序列登录号:No.MF693155)。(2)BoMYB51超量表达及功能分析构建BoMYB51超量表达载体并对拟南芥进行遗传转化,得到5个转基因株系。通过Real-time PCR方法分析吲哚族芥子油苷相关基因的表达模式,发现核心结构合成相关基因TSB1、CYP79B2、CYP83B1和SOT16上调表达,结构修饰基因CYP81F2和IGMT2表达水平则不变,而吲哚族芥子油苷降解基因TGG1和PEN2和吲哚族芥子油苷合成调控基因MYB34和MYB122的表达水平下降。通过高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)检测野生型和超量表达拟南芥的芥子油苷含量,发现超量表达BoMYB51的拟南芥中吲哚族芥子油苷的含量显著升高,脂肪族芥子油苷除了萝卜硫素(4-methyl sulphinylbutyl Glucosinolate,4MSOB)含量下降外没有显著变化。结果表明BoMYB51可以通过提高吲哚族芥子油苷合成基因的表达来提高吲哚族芥子油苷的含量。通过Flg22处理野生型和超量表达的拟南芥植株,检测胼胝质的沉积,发现在正常情况下,超量表达拟南芥的胼胝质沉积比野生型强。而Flg22处理下,野生型和超量表达拟南芥的胼胝质沉积都被诱导,而超量表达拟南芥的诱导程度更强。结果表明超量表达BoMYB51可以增强Flg22诱导的胼胝质沉积从而抵御病原菌侵害。(3)BoMYB51启动子驱动的GUS组织定位表达模式分析构建BoMYB51启动子驱动的GUS表达载体并对拟南芥进行遗传转化,通过GUS染色分析BoMYB51的组织定位表达情况。结果表明在幼苗的子叶、真叶和根中均有明显的GUS信号,成苗期的叶片、叶柄、茎、花序和未成熟的角果上部分也有明显的GUS信号。表明BoMYB51启动子广泛的表达在植物各组织中。不同激素和胁迫处理下,BoMYB51启动子驱动的GUS表达也不相同。水杨酸(Salicylic acid,SA)和茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate,MeJA)显著促进GUS表达,脱落酸(Abscisic acid,ABA)和乙烯(Ethylene,ET)对GUS表达没有明显影响,而赤霉素(Gibberellin acid,GA)表现出了不同组织的GUS特异表达现象。机械损伤系统的诱导了GUS表达,Flg22、盐、和紫外线(Ultraviolet,UV)处理也增强的GUS表达,说明BoMYB51启动子活性不仅响应激素的诱导,而且也响应生物和非生物的胁迫。(4)BoMYB51在西兰花中的表达模式分析通过Real-time PCR法分析BoMYB51在西兰花中的表达模式,证实了BoMYB51在各组织均有表达且与拟南芥中BoMYB51启动子驱动的GUS组织表达情况相同。在不同激素和胁迫处理下,BoMYB51表达受SA、JA、Flg22、盐、机械损伤和UV的诱导,GA处理时分开检测子叶和真叶的表达发现子叶中BoMYB51表达被诱导,真叶中BoMYB51表达被抑制,这些结果与BoMYB51启动子驱动的GUS的表达情况一致。然而在ABA、ET和干旱胁迫下,BoMYB51的表达被诱导,与GUS表达情况不一致。综上,BoMYB51响应多种激素信号途径,并且可能在非生物胁迫中也起到一定的作用。
【学位单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q943.2;S635.3
【部分图文】：
的防卫机制[12, 13]。1.2 吲哚族芥子油苷研究进展1.2.1 吲哚族芥子油苷合成途径吲哚族芥子油苷的合成途径有两个阶段：核心结构的形成和氨基酸侧链的次级修饰（图1-1）。细胞色素 P450 单加氧酶（CYPs）在核心结构形成的初始阶段起重要作用。CYP79B2和 CYP79B3 催化色氨酸形成吲哚-3-乙醛肟（Indole-3-acetaldoxime, IAOx）[14, 15]，IAOx 在CYP83B1 的作用下代谢为氧化形式[16, 17]，可以与硫醇类物质反应形成硫化肟集团，在 C-S裂 解 酶 （ SUR1 ） 与 葡 萄 糖 基 转 移 酶 （ UGT74B1 ） 的 作 用 下 形 成 脱 硫 的 芥 子 油 苷（desulfo-glucosinolate）[18]，最后经过磺基转移酶（SOT16）的硫酸化作用形成吲哚-3-甲基芥子油苷（Indol-3-ylmethyl-glucosinolate, I3M）[19]。吲哚族芥子油苷的次级修饰主要包括羟基化和甲基化。吲哚-3-甲基芥子油苷（I3M）经过 CYP81Fs 催 化 转 化 为 中 间 产 物 1- 羟 基 - 吲 哚 -3- 甲 基 芥 子 油 苷（1-hydroxy-indol-3-ylmethyl-glucosinolate, 1HO-I3M）和 4-羟基-吲哚-3-甲基芥子油苷（4-hydroxy-indol-3-ylmethyl-glucosinolate, 4HO-I3M）[20]，这些中间产物在吲哚族芥子油苷甲基转移酶 1 和 2（IGMT1, IGMT2）的作用下进一步转化成为 1-甲氧基-3-吲哚甲基（ 1-methoxy-indole-3-ylmethyl-glucosinolate, 1MO-I3M ） 和 4- 甲 氧 基 -3- 吲 哚 甲 基（4-methoxy-indole-3-ylmethyl-glucosinolate, 4MO-I3M）[13
图 1-2 R2R3-MYBs 12 亚族的进化关系[25]Figure 1-2 Relationship between subgroup 12 R2R3-MYBs[25]YB34，MYB51 和 MYB122 统称为 HIG-MYBs（high indolic GSL），调控吲哚族芥子成。MYB28，MYB29 和 MYB76 统称为 HAG-MYBs（high aliphatic GSL），调控脂油苷的合成。2005 年，Celenza 等发现 MYB 类转录因子 MYB34 促进吲哚族芥子油
图 1-3 植物防卫调控吲哚族芥子油苷的信号模式[78]ignalling model for indolic glucosinolate regulation in pl激比如虫害或病菌侵害，细胞损坏，芥子油苷与其油苷的含量。拟南芥遭遇桃蚜（Myzus persicae）后究发现吲哚族芥子油苷含量不变[80]。拟南芥遭遇甜菜
【参考文献】
本文编号：2836645
【学位单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q943.2;S635.3
【部分图文】：
的防卫机制[12, 13]。1.2 吲哚族芥子油苷研究进展1.2.1 吲哚族芥子油苷合成途径吲哚族芥子油苷的合成途径有两个阶段：核心结构的形成和氨基酸侧链的次级修饰（图1-1）。细胞色素 P450 单加氧酶（CYPs）在核心结构形成的初始阶段起重要作用。CYP79B2和 CYP79B3 催化色氨酸形成吲哚-3-乙醛肟（Indole-3-acetaldoxime, IAOx）[14, 15]，IAOx 在CYP83B1 的作用下代谢为氧化形式[16, 17]，可以与硫醇类物质反应形成硫化肟集团，在 C-S裂 解 酶 （ SUR1 ） 与 葡 萄 糖 基 转 移 酶 （ UGT74B1 ） 的 作 用 下 形 成 脱 硫 的 芥 子 油 苷（desulfo-glucosinolate）[18]，最后经过磺基转移酶（SOT16）的硫酸化作用形成吲哚-3-甲基芥子油苷（Indol-3-ylmethyl-glucosinolate, I3M）[19]。吲哚族芥子油苷的次级修饰主要包括羟基化和甲基化。吲哚-3-甲基芥子油苷（I3M）经过 CYP81Fs 催 化 转 化 为 中 间 产 物 1- 羟 基 - 吲 哚 -3- 甲 基 芥 子 油 苷（1-hydroxy-indol-3-ylmethyl-glucosinolate, 1HO-I3M）和 4-羟基-吲哚-3-甲基芥子油苷（4-hydroxy-indol-3-ylmethyl-glucosinolate, 4HO-I3M）[20]，这些中间产物在吲哚族芥子油苷甲基转移酶 1 和 2（IGMT1, IGMT2）的作用下进一步转化成为 1-甲氧基-3-吲哚甲基（ 1-methoxy-indole-3-ylmethyl-glucosinolate, 1MO-I3M ） 和 4- 甲 氧 基 -3- 吲 哚 甲 基（4-methoxy-indole-3-ylmethyl-glucosinolate, 4MO-I3M）[13
图 1-2 R2R3-MYBs 12 亚族的进化关系[25]Figure 1-2 Relationship between subgroup 12 R2R3-MYBs[25]YB34，MYB51 和 MYB122 统称为 HIG-MYBs（high indolic GSL），调控吲哚族芥子成。MYB28，MYB29 和 MYB76 统称为 HAG-MYBs（high aliphatic GSL），调控脂油苷的合成。2005 年，Celenza 等发现 MYB 类转录因子 MYB34 促进吲哚族芥子油
图 1-3 植物防卫调控吲哚族芥子油苷的信号模式[78]ignalling model for indolic glucosinolate regulation in pl激比如虫害或病菌侵害，细胞损坏，芥子油苷与其油苷的含量。拟南芥遭遇桃蚜（Myzus persicae）后究发现吲哚族芥子油苷含量不变[80]。拟南芥遭遇甜菜
【参考文献】
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3 苑鑫;戴绍军;陈思学;阎秀峰;;NaCl胁迫对拟南芥莲座叶中芥子油苷含量的影响[J];东北林业大学学报;2008年03期
4 陈亚州;阎秀峰;;芥子油苷在植物-生物环境关系中的作用[J];生态学报;2007年06期
本文编号：2836645
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