萝卜全基因组NBS-LRR抗病基因鉴定与NBS抗病基因同源序列克隆

发布时间：2020-10-17 20:29

　　 萝卜(Raphanus sativus L.,2n=2x=18),十字花科萝卜属一、二年生根菜类蔬菜,是广泛种植于我国的重要经济作物。萝卜在生长过程中易受各种病原菌侵袭而诱发病害,导致萝卜品质差,产量下降,进而造成重大经济损失。因此,选育萝卜抗病新品种成为控制病害发生的有效途径。近年来,随着全基因组测序工作的完善,利用全基因组序列进行抗病基因分离已成为抗性研究热点。研究表明,含有核苷酸结合位点(NBS)结构域的抗病基因为抗病基因家族中数量最多的一类,在抵御病原菌侵染方面起重要作用。然而,萝卜全基因组NBS-LRR类抗病基因的分离鉴定工作尚未见报道,而且萝卜NBS抗病基因同源序列分离工作仍有待进一步深入。本研究鉴定分析了萝卜全基因组中NBS-LRR类抗病候选基因序列,并对部分候选基因进行分离克隆。另外,利用NBS保守结构域设计简并引物,分离萝卜抗病基因同源序列,同时分析了部分克隆基因和同源序列的表达,本文主要研究结果如下:1、萝卜全基因组中共鉴定到188个含NBS结构域的抗病候选基因,根据C端是否含TIR结构,可将188个基因分成128个TIR-NBS-LRR和60个non-TIR-NBS-LRR(CC-NBS-LRR)两大类。其中,74个RsNBS基因(39.36%)定位于萝卜连锁群R1-R9上。RsNBS基因在连锁群中分布相对分散,数量也各有不同。本研究中部分基因以基因簇形式存在,共鉴定到12个基因簇。R7上基因数最多(13个RsNBS基因),R6含有的基因簇最多(3个基因簇),R8所含基因簇中基因数最多(6个RsNBS基因)。2、进化关系研究表明,萝卜NBS-LRR基因与拟南芥NBS类抗病基因具有较近的亲缘关系。基序和基因结构分析表明,188个萝卜抗病候选基因中均包含NBS保守结构域,并且包含保守基序(P-loop、RNBS-A、Kinase-2、RNBS-B和GLPL)和保守结构域(TIR、CC和LRR等)。基因结构分析发现,RsNBS基因含有平均外显子数为4.87。TNL类和CNL类RsNBS基因平均外显子个数分别为5.59和3.33个,而部分CNL类RsNBS基因(28.3%)由单个外显子编码而成。除RsNBS164外,其余TNL类RsNBS基因均由2个以上外显子构成。3、利用简并引物进行PCR扩增,从萝卜中分离到50条具有完整开放阅读框的抗病基因同源序列(RGAs),将其命名为RsRGA01-RSRGA50。聚类进化分析表明,50条同源序列分为TNL和CNL两类,分别含有14条和36条抗病基因同源序列,又可细分为 RsRGAⅠ、RsRGA Ⅱ、RsRGA Ⅲ、RsRGA Ⅳ、RsRGA Ⅴ 和 RsRGA Ⅵ。序列比对和基序分析表明所有序列均含有P-1oop、RNBS-B和kinase-2基序。其中,RsRGA31与拟南芥RPM1的相似性达89.77%,推测其可能与RPM1同源,且具有相似功能。对本研究中部分RsNBS基因进行DNA序列克隆,验证了数据库准确性。qRT-PCR分析结果表明,3个RsRGAs序列(RsRGA08、RsRGA34、RsRGA44)和4个 RsNBS基(RsNBS021、RsNBS044、RsNBS062、RsNBS164)在不同萝卜品种不同处理下呈现出差异表达模式,推测这些序列和基因在萝卜抗病防御信号途径中发挥重要作用。
【学位单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S436.31
【部分图文】：

（Ｍｅｙｅｒ?ｅｔａｌ．，?２００３；?Ｍｅｙｅｒ?ｅｔａｌ．，?１９９９：?Ｐａｎ?ｅｔａｌ．，２０００）。ＲＮＢＳ－Ｄ?并不是总是存在于??ＴＩＲ和ＣＣ结构域中，这可能是为了促使其与ＡＲＣ２发生相互作用而与Ｎ端所含结构??域共同进化的结果（Ｄｅｓｌａｎｄｅｓ?ｅｔ?ａｌ．，?２０１２）。图１－１描述ｒ几种常见Ｒ蛋白的多种基序??及其结构组成。??Ａ??Ｔ１Ｒ?ＮＢ?ＡＲＣ１?ＡＲＣ２?ＬＲＲ??ＴＳＲＩ?ｒ（Ｒ２ＴＩＲＪ?Ｐ－ｉｏｏｐＫｔｎａｓｅ－２?ＫＮ？Ｓ－？?ＧＬＰＬ?ＭＨＤ??ｉ?Ｉ?ｉｉｓ??ＣＮＬ?ｍ????ＥＤＶＩＤ?ＲＮＢＳ－Ｄ??ＣＣ??Ｂ??ＳＰ?ＬＲＲ?ＴＭ?Ｋｉｎａｓｅ??ＲＬＫ?—尸厂—；??ＲＬＰ?｜?—厂－??图１－１四种主要植物Ｒ蛋白常见结构示意图（Ｓｅｋｈｗａｌｅｔａｌ．

行进化分析，并使用ＣＬＵＳＴＡＬＷ对ＮＢＳ结构域进行序列比对。为了深入研究萝卜中??ＮＢＳ－ＬＲＲ抗病基因的系统发育关系，先使用Ｎ－Ｊ法对１３７个拟南芥ＮＢＳ基因进行系??统进化树构建，验证拟南芥中ＮＢＳ蛋白的分类（图２－１Ａ）。根据拟南芥ＮＢＳ蛋白家??族的分类，可将萝卜中ＮＢＳ蛋白分为２大亚群——ＴＮＬ类（１２８）和ＣＮＬ类（６０）。??胃謂｜?■羣??图２－１萝卜与拟南芥ＮＢＳ－ＬＲＲ蛋白进化分析??（Ａ）拟南芥ＮＢＳ蛋白进化树；（Ｂ）?ＲｓＮＢＳ蛋白和ＡｔＮＢＳ蛋白进化树??Ｆｉｇ．?２－１?Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ?ｔｒｅｅ?ｏｆ?ＲｓＮＢＳ?ａｎｄ?ＡｔＮＢＳ?Ｐｒｏｔｅｉｎｓ??（Ａ）?Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ?ｔｒｅｅ?ｏｆ?ＡｔＮＢＳ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ；?（Ｂ）?Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ?ｔｒｅｅ?ｏｆ?ＲｓＮＢＳ?ａｎｄ?ＡｔＮＢＳ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ??分别对萝卜中ＴＮＬ类和ＣＮＬ类ＮＢＳ蛋白进行了系统进化分析（图２－２，图２－３）。??根据系统进化树结果表明，我们发现ＴＮＬ类抗病基因的数量与ＣＮＬ类抗病基因的数??量呈现２：１的比例，这与在拟南芥中的发现类似（Ｍｅｙｅｒｓｅｔａｌ．，２００３）。另外，双子叶??和单子叶植物中ＴＮＬ和ＣＮＬ两个亚类的抗病基因数目不同。萝卜中ＴＮＬ类抗病基??因占主要优势，１２８个ＴＮＬ类ＮＢＳ基因，被分成９个亚群（图２－３），占萝卜ＮＢＳ基??因总数的?６８％，分别是?ＴＮＬ－Ａ（９）、ＴＮＬ－Ｂ（１７）、ＴＮＬ－Ｃ（２）、ＴＮＬ－Ｄ（１２）、ＴＮＬ－Ｅ（７）、??ＴＮＬ－Ｆ（７）、ＴＮＬ－Ｇ（３７）、ＴＮＬ－Ｈ（２３）、ＴＮ（１４）。其中?ＴＮＬ－Ｇ?类基因数最多

??图２－４萝卜ＮＢＳ蛋白和基因结构分析。（Ａ）?１８８个ＲｓＮＢＳ蛋白进化分析；（Ｂ）?１８８个ＲｓＮＢＳ基??因内含子－外显子结构分析；（Ｃ）?１８８个ＲｓＮＢＳ蛋白保守基序分析??Ｆｉｇ．?２－４?Ｔｈｅ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＲｓＮＢＳ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ?ａｎｄ?ｇｅｎｅｓ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．?（Ａ）?Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ?ｔｒｅｅ?ｏｆ?ＲｓＮＢＳ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ；??（Ｂ）?Ｉｎｔｒｏｎ－ｅｘｏｎ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ?ｏｆ?ＲｓＮＢＳ?ｇｅｎｅｓ；?（Ｃ）?Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ?ｍｏｔｉｆ?ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ?ｏｆ?ＲｓＮＢＳ??ｐｒｏｔｅｉｎｓ??由于ＲｓＮＢＳ０８５蛋白序列在靠近终止密码子一端存在３９个未知氨基酸，故不对??其进行蛋白分析。萝卜ＮＢＳ蛋白的相对分子质量（ＭＷ）在３．４到３１１．５ＫＤａ之间，??理论等电点（ｐｉ）在４．９７到９．５７范围内。１３４个ＲｓＮＢＳ蛋白的理论等电点小于７，说??明这些蛋白为酸性（图２－５Ａ）。ＲｓＮＢＳ蛋白的ＭＷ在５０－２００ＫＤａ范围内较集中，拥??有１７１个成员，占蛋白总数的９０．９％?（图２－４Ａ）。脂肪系数分析表明，大多数ＲｓＮＢＳ??蛋白含有大量脂肪氨基酸，此外，所有ＲｓＮＢＳ蛋白均被预测为亲水性蛋白（图２－５Ｂ）。??不稳定系数在一定程度上能反应蛋白的结构稳定性，ＲｓＮＢＳ蛋白平均不稳定系数为??４４．６９?（＞４０．０）
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本文编号：2845282