葡萄VvXDH1、VvOPR1基因生物信息学分析及基因合成和功能鉴定

发布时间：2020-10-23 13:54

　　 葡萄是(Vtis vinifera)是一类在生产中具有很高栽培价值的果树,然而,在葡萄的栽培过程中经常会遇到盐害、高温、干旱、重金属、化学毒害等逆境胁迫,这对葡萄的品质和产量都造成很大的影响。生产上葡萄的繁殖也通常采用扦插、嫁接等无性繁殖,这既缩短了育苗所需时间还可以保持葡萄原品种性状的稳定性。因此,探析葡萄抗逆基因的功能并通过基因工程技术培育抗逆性强的葡萄砧木对葡萄及其他果树的栽培具有重要的实践意义。黄嘌吟脱氩酶(Xanthine dehydrogenase,XDH)是嘌呤代谢过程中的一种重要的酶,催化次黄嘌呤和黄嘌呤生成尿酸,植物XDH基因与各种代谢活动相关;12-氧-植物二烯酸还原酶(12-OXO-phytodienoic acid reductase,OPR)是茉莉酸(Jasmonic acid,JA)生物合成途径中的一个关键酶,目前对整个植物基因组中OPR基因家族的进化及功能仍不是很清楚。本文首先对VvXDH1、VvOPR1、基因进行了生物信息学分析并预测了其功能;接着利用基于 PCR 的两步 PTDS 法(PCR-based two-step DNA synthesis quantificational reverse-transcription),优化并合成了葡萄(V.vinifera)的XDH1基因(VvXDH1)以及OPR1基因(VvOPR1);最后通过模式植物拟南芥和水稻对葡萄VvXDH1和VvOPR1基因进行了功能研究,以期探讨VvXDH1和VvCOPR1基因的逆境胁迫应答机制以及为利用这些基因进行葡萄或其他果树、植物的基因工程改良或表达调控提供理论依据,主要研究结果如下:1.我们对VvXDH1基因的序列进行了分析发现,VvXDH11的开放阅读框(ORF)为4077bp,编码一个由1358个氨基酸组成的蛋白质。推导的VvXDH1氨基酸序列与拟南芥(Arabidopsisthaliana)XDH1(AtXDH1)有76.26%的同源性;构建的同源进化树表明,VvXDH1在进化关系上与AtXDH1同源性较高。VvXDH1三级结构与二级结构分析表明:XDH1是一种同型二聚体结构,存在两个亚基,每个亚基包含有4个相辅因子(Molybdenum cofactor,Moco)、2个2Fe/2S中心、1个NAD结合域(即黄素腺嘌吟二核苷酸(Flavine Mononucleotide,FAD)FAD和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADPH结合域)和1个底物结合区。VvOPR1与LeOPR1、AtOPR1蛋白经氨基酸序列比对后发现同源性分别高达76.78%、70.30%;并对VvOPR1开展进化树、三级结构分析后认为VvOPR1基因很可能不参与JA生物合成途径而在防御逆境胁迫中发挥作用。另外,本实验以美人指葡萄品种为试材,鉴定了 VvXDH1和VvOPR1在不同器官的表达水平,结果表明,VvXDH1和VvH1在葡萄的各个组织中均有表达,前者在叶中表达量最高,茎次之,根中表达量最低;后者在根和茎中的表达量较高,在叶中的表达量较低。2.根据NCBI登录的VvXDH1的氨基酸序列(GenBank Accession No:XP_002285473),进行结构优化,利用 PTDS(PCR-basedDNAsynthesis,PTDS)方法合成了来源于葡萄的XDH1基因命名为VvXDH1S。为了更进一步分析VvXDH1基因的功能,本研究构建了农杆菌-植物双元表达载体YN36,并让VvXDH1S基因在拟南芥中过量表达。结果表明,过量表达VvXDH1S基因的拟南芥在不同浓度的盐分胁迫下的萌发率、根长和鲜重较野生型显著提高;转基因拟南芥在200mMNaCl处理下的第5天、第15天都显示了较高的XDH1活性,通过一系列生理指标测定,进一步证明了 VvXDH1S基因过表达株系较野生型株系更能够在盐分胁迫下保持体内含水量、叶绿素、脯氨酸、脱落酸(ABA)、尿囊素的累积;减少体内丙二醛(MDA)含量;同时保持较高的抗氧化物酶活性。随后的实时定量PCR(qRT-PCR)分析也证明了在盐分胁迫下,VvXDH1S过表达的拟南芥的 AtNCED3、AtZEP、AtP5CS、AtSOD、AtPOD、AtCAT基因较野生型都显示了较高的表达水平。上述实验结果表明,VvXDH1S基因过表达提高了植物耐盐性而且本文就其耐盐机理做了探讨。3.根据葡萄的12-氧-植物二烯酸还原酶(OPR)基因序列设计引物,再通过基于PCR的两步PTDS方法扩增合成了VvOPR1 基因。经过载体构建,农杆菌介导将VvOPR1S基因转入到拟南芥和水稻中,并以此为材料进行水培试验,研究了铜、锌胁迫对转基因植株萌发、生长、生理生化特性的影响以及铜、锌在水稻植株体内不同部位的积累,并运用qR-TPCR技术进行转基因水稻抗氧化保护酶基因表达量分析以探讨VvOPR1基因的功能。试验结果显示,在不同浓度的铜单一处理、锌单一处理试验下,转VvOPR1S基因拟南芥的萌发率、根长、鲜重都显著高于野生型拟南芥(对照),同时,转基因水稻的生长也显著高于野生型水稻(对照)。溶液培养试验发现铜、锌胁迫处理转VvOPR1S基因水稻叶片中的叶绿素含量、叶绿素a和叶绿素b含量的比值(Chla/Chlb)、Fv/Fm降低且下降幅度显著小于野生型水稻;MDA含量、电导率增大且增幅显著小于野生型水稻;SOD、POD活性增高且增幅显著高于野生型水稻,但CAT活性降低且降幅显著低于野生型水稻;铜、锌胁迫使转基因水稻叶片的OsSOD、OsPOD、OsCAT基因的表达量增加且增幅大于野生型水稻;另外,转基因水稻对铜、锌的转运能力也显著高于野生型水稻。这些结果表明转VvOPR1S基因水稻在重金属铜、锌胁迫中能够保持较高的光合效率、重金属转运能力,并通过提高抗氧化保护酶基因表达水平以维持较高的酶活性来应答铜、锌重金属胁迫。综合分析表明,葡萄VvXDH1、VvOPR1基因能够提高葡萄的耐盐、耐重金属胁迫能力。这既为探索葡萄基因的功能开拓了新视野,又为利用基因工程、无性繁殖等手段获得具有优良抗逆性状的葡萄砧木新品种提供依据,同时又为植物修复盐碱地、重金属污染土壤提供新思路。
【学位单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S663.1
【部分图文】：

究进展??ｅ?ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，?ＸＤＨ）是一种钼酶理作用与植物体内的钼酶有着紧酶（ｎｉｔｒａｔｅ?ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＮＲ）、亚硫酸ｏｘｉｄａｓｅ，?Ａ０）等４种钼酶已在植物以尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（ＮＡ铁氧还蛋白（Ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ）、黄素腺而发生脱氢反应的酶（Ｗｏｏｌｆｏｌｋ＆?黄嘌呤（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｅ）、黄嘌呤（Ｘ非常重要的作用（Ｚｄｕｎｅｋ－Ｚａｓｔｏｃｋ在于植物的不同器官、组织中（Ｂｍｙ有：次黄嘌呤、黄嘌呤，而嘌呤、ｌ．，２００４）。??．Ｘａｎｔｈｉｎｅ??ＮＡＤ??

Ｆｉｇ．２－１?Ｐｈｙｌｏｇｅｎｔｉｃ?ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ?ｏｆ?ＸＤＨｓ??２．１．２?ＶｖＸＤＨｌ氨基酸序列比对及二级结构分析??通过对ＸＤＨ基因家族进化树（图２－１）的分析，我们选取了与葡萄（Ｋ?ｖ／？丨ｙｆｅｒａ，?Ｋｖ）??相似性最高的拟南芥鹰嘴豆（Ｃ．狀／￡伽＿，〇７），以及相似性较小??的家査（５．?？７〇ｒ／，?５ｗ）和莱茵衣藻（Ｃ．?Ｃｒ）来分析ＸＤＨ蛋白结构（｜冬丨２－２）。??从图中我们知道，ＸＤＨ蛋白主要包括如下的功能区域：２个２Ｆｅ／２Ｓ中心（铁硫蛋白??作为电子载体），一个ＮＡＤ结合域，一个底物结合域和４个钼辅因子（Ｍｏｃｏ）?（Ｏｒｉｅｔ??ａｌ．，?＂＾（Ｋｏｍｏｔｏｅｔａｌ．，?１９９９），?Ｍｏｃｏ?—方面作为底物结合域，在电子受体存在的条件??下使黄嘌呤转化成尿酸；另一方面Ｍｏｃｏ还作为氧化还原部位，当处于有氧??３２??

通过采用ｑＲＴ－ＰＣＲ?（Ｒｅａｌ?Ｔｉｍｅ?Ｑｕａｎｉｔａｔｉｖｅ?ＰＣＲ）技术对基因的相对转??录水平进行分析从而了解该基因在葡萄＋同组织中的表达。的荧光定量ＰＣＲ??结果显示：该基因在葡萄叶中的表达水平最高，根中的表达水平最低（图２－３）。早期??就曾介研宄报道基因缺失的转基因拟南芥植株与对照相比，其生长和发育都??受到了影响，并且加速了叶片的衰老（Ｎａｋａｇａｗａｅｔａｌ．，２００７）。所以推测基??因与葡萄植株的抗逆性以及叶片的衰老有一定的关系。??１０?■??Ｉ?９??Ｓ?８?－?，，Ｔ，＿??Ｉ－?寵?戀??ｉ：：?＿?＿??ｉ２?？?圍?圍??”?ｒ?＾?．圓．圓—，??根／Ｒｏｏｔ?荃／Ｓｔｅｍ?叶／Ｌｅａｆ??葡萄不同组织／Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｔｉｓｓｕｅｓ?ｏｆ?ｇｒａｐｅ??图２－３ＦｖＸＤ／／／基因在葡萄不同组织中的ｑＲＴ－ＰＣＲ表达分析??Ｆｉｇ．２－３?ＶｖＸＤＨｌ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｐａｔｔｅｒｎｓ?ｉｎ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｔｉｓｓｕｅｓ?ｏｆ?ｇｒａｐｅ?ｒｅｖｅａｌｅｄ?ｂｙ?ｑＲＴ－ＰＣＲ．??２．２ＶｖＯＰＲｌ生物信息学分析??２．２．１对ＯＰＲ家族同源基因鉴定??借助ＮＣＢＩ等公共数据库，同时结合目前植物基因组测序方面的研究，本文分别??从藻类、苔藓、蕨类、裸子、单子叶和双子叶植物中选取了些许植物并鉴定了这些植??物的ＯＰＲ及其同源基因以探宄植物０ＰＲ基因家族的起源和进化。具体植物主要有蕨??类的卷柏ｍ呢／／伙而〈饰，Ｓｗ）；藻类的莱茵衣藻獅脱ｖ?ｒ命肌／／／／，??Ｏ）；苔藓类的小立碗藓（尸ｈｙｓｒ麵／Ｙｒ＾／ｔｏ攸ｍ、

本文编号：2853123