外源RdreB1BI基因提高‘红颊’草莓耐寒与耐旱分子机理

发布时间：2020-10-23 16:03

　　 草莓(Fragaria × ananassa Duch.)属于蔷薇科草莓属多年生草本植物,是重要的经济植物。低温胁迫影响草莓生长发育,是草莓越冬生产的主要限制因素,利用基因工程技术培育耐寒草莓品种是快速有效的育种途径。DREB/CBF转录因子是重要的逆境应答调控因子,其中DREB1B在植物耐寒性方面具有重要的作用。本研究以水稻RdreB1BI转基因'红颊'草莓单拷贝耐寒株系为试验材料,借助数字基因表达谱技术(digitalgeneexpression,DGE)获得了低温胁迫下RdreB1BI转基因草莓的转录组数据,分析差异表达的基因,并利用双向凝胶电泳技术(2-DE)和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF/TOF)探究低温胁迫后RdreB1BI转基因草莓中差异积累的蛋白质。进而从蛋白组和转录组数据中发掘花青苷和AQP等相关作用因子,从组学、形态及生理水平上系统研究了RdreB1BI提高'红颊'草莓耐寒性及耐旱性的分子机制。主要研究结果如下:1.为了研究RdreB1BI在基因调控方面介导草莓耐寒性的作用机理,利用Illumina/Solexa高通量测序技术,获得了RdreB1B 转基因及非转基因草莓在低温胁迫下的数字基因表达谱信息,每个样品获得超过350万个干净标签。转基因与非转基因植株有1119个差异表达基因。低温诱导后非转基因植株中有1202个差异表达基因,转基因植株中有1517个差异表达基因,其中有443个共有差异表达基因。共有差异基因中编码PP2C、PIF、GDSL脂肪酶等逆境响应蛋白的功能基因在转基因植株中的差异表达倍数显著高于非转基因植株。此外部分调控基因在转基因植株中特异表达,RdreB1B1可通过DRE/CRT顺式作用元件与逆境相关转录因子诸如ZFP、bZIP、NAC等相互作用共同调控转基因植物的耐寒性。2.为了进一步研究RdreB1BI在蛋白调控方面介导草莓耐寒性的作用机理,利用双向凝胶电泳技术和质谱测序技术分析低温胁迫下非转基因和RdreB1BI转基因草莓的差异蛋白质积累图谱。检测到超过300个重演性较高的蛋白质点(p0.05),与非转基因草莓的蛋白质图谱比较,有21个蛋白点的丰度差异在2倍以上,经测序及蛋白质序列比对分析表明这些差异蛋白质包括光合作用蛋白(RCA1)、抗氧化物蛋白(Cu/Zn-SOD)、胚胎发育晚期丰富蛋白(Lea14-A)、真核细胞翻译启动因子(eIF5A)等。其中RCA1、Cu/Zn-SOD和eIF5A与转录组中相应差异基因的关联性较强,这些胁迫相关蛋白的积累有助于提高草莓耐寒性,相关差异积累蛋白的鉴定为DREB1B靶蛋白的研究提供了新的目标。3.结合转录组数据及植株生理表型,研究表明花青苷合成途径中关键酶编码基因在RdreB1BI转基因草莓中差异表达,并且转基因植株存在明显的花青苷积累。这些基因包括PAL、C4H、4CL、CHI、F3H、DFR等,大部分基因在转基因植株中上调表达,它们参与了从苯丙氨酸到花青苷的合成代谢途径。另外,这些基因的启动子区域含有能被DREB1B特异识别的DRE/CRT顺式作用元件(G/ACCGAC)。RdreB1BI转基因草莓植株叶柄基部及匍匐茎上有明显的花色素积累。花青苷相关功能基因及转录因子基因在转基因草莓叶片、匍匐茎及果实中都有明显地上调表达。结果表明RdreB1BI增强了转基因植株中花青苷相关基因的表达,促进了花青苷含量的积累,有助于转基因植株耐寒性的提高。4.蛋白质组和转录组数据显示RdreB1BI转基因草莓中与干旱相关的蛋白质积累丰度和基因表达量与非转基因植株相比具有显著差异,因此我们进一步研究了转RdreB1BI基因草莓对干旱胁迫的响应。研究结果表明RdreB1BI能特异结合差异表达基因FvPIP2;1的启动子区域,并促进PIP相关水通道蛋白基因的表达。生理层面上,转基因草莓在干旱胁迫下质膜相对电导率显著低于非转基因植株,且转基因草莓具有较高的相对含水量,干旱处理后转基因草莓气孔开度显著小于非转基因植株,此外抗氧化酶POD、SOD酶活性较高,过氧化物质MDA含量较低,转基因植株表现出较高的耐旱性。通过荧光定量PCR表达分析,转基因植株中NAC、RD22、ABI、NCED等基因的表达量明显高于非转基因植株。从形态、生理和转录水平结果表明RdreBIBI转基因草莓同时具有较高的耐旱性。
【学位单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S668.4
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一章 文献综述
    1 植物耐寒性研究进展
        1.1 低温胁迫对植物细胞膜的影响
        1.2 低温胁迫对植物光合作用的影响
        1.3 低温胁迫对植物呼吸作用的影响
        1.4 低温胁迫对植物保护酶活性的影响
        1.5 植物响应低温胁迫的功能蛋白
    2 DREB1s/CBFS转录因子研究进展
        2.1 DRE/CRT顺式作用元件
        2.2 DREB1s/CBFs家族
        2.3 DREB1s/CBFs的表达调控
        2.4 DREB1s/CBFs在植物耐寒性中的作用
    3 植物蛋白组学与转录组学研究
        3.1 蛋白质组学的研究策略
        3.2 蛋白质组学在环境胁迫中的应用
        3.3 蛋白质组学在转基因植物中的应用
        3.4 植物转录组学与数字表达谱技术
        3.5 数字基因表达谱的应用
    4 草莓基因工程育种研究
        4.1 草莓转基因育种概况
        4.2 草莓耐寒转基因育种
    5 研究目的与意义
第二章 低温胁迫下RdreB1BI转基因'红颊'草莓转录组学研究
    1 材料与方法
        1.1 植物材料与处理
        1.2 试剂与设备
        1.3 构建cDNA文库以及高通量测序
        1.4 数字基因表达谱的生物信息学分析
        1.5 Gene Ontology功能与Pathway显著性富集分析
        1.6 差异表达基因荧光定量PCR验证
    2 结果与分析
        2.1 Tag分析
        2.2 差异表达基因统计
        2.3 差异表达基因的GO分类
        2.4 差异表达基因的通路富集分析
        2.5 转基因和非转基因草莓中同时差异表达基因比较
        2.6 编码转录因子的差异表达基因
        2.7 荧光定量PCR验证
    3 讨论
        3.1 转基因和非转基因草莓的转录组差异
        3.2 非生物逆境胁迫相关基因
        3.3 转录因子间的相互作用
第三章 低温胁迫下RdreB1BI转基因'红颊'草莓蛋白质组学研究
    1 材料与方法
        1.1 植物材料与处理
        1.2 总蛋白质的提取与定量
        1.3 双向凝胶电泳
        1.4 凝胶图像分析和质谱鉴定
        1.5 蛋白质信息搜索
    2 结果与分析
        2.1 RdreB1BI转基因和非转基因草莓叶片2-DE蛋白图谱分析
        2.2 差异蛋白质分类
    3 讨论
        3.1 低温胁迫下光合作用相关的差异蛋白质
        3.2 细胞质中铜/锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）
        3.3 胚胎发育后期富集蛋白（LEA）
        3.4 真核生物翻译起始因子（eIF5A）
        3.5 冷响应相关的表达序列标签（ESTs）
第四章 外源RdreB1BI基因对'红颊'草莓花青苷积累的影响
    1 材料与方法
        1.1 植物材料
        1.2 试剂与设备
        1.3 花青苷含量测定
        1.4 荧光定量PCR分析
    2 结果与分析
        2.1 转录组数据中的花青苷合成途径
        2.2 草莓植株及果实中花青苷含量的测定
        2.3 花青苷合成相关基因的转录表达分析
    3 讨论
第五章 外源RdreB1BI基因对'红颊'草莓耐旱性影响
    1 材料与方法
        1.1 植物材料与干旱处理
        1.2 酵母单杂交
        1.3 生理指标测定
        1.4 RNA提取及荧光定量PCR
        1.5 统计分析
    2 结果与分析
        2.1 转录组中筛选出的差异表达基因
        2.2 差异表达基因的启动子序列分析
        2.3 酵母单杂交分析
        2.4 FvPIP2;1启动子区顺式作用元件分析
        2.5 干旱胁迫下植株和气孔的观察与比较
        2.6 干旱胁迫下细胞膜稳定性和叶片水分状态
        2.7 干旱胁迫下抗氧化酶活性和脂质过氧化物含量
        2.8 AQP及逆境相关基因的转录水平分析
    3 讨论
参考文献
全文结论
创新点
攻读学位期间发表的学术论文
致谢

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本文编号：2853242