高羊茅热激转录因子FaHsfC1b的克隆与耐热性功能鉴定

发布时间：2020-10-31 03:43

　　 高羊茅是耐热性最强的冷季型草坪草之一,在气候过渡地带得到了广泛的种植,发掘高羊茅耐热相关基因对提高冷季型草坪草耐热性有重要的意义。另外,热激转录因子在植物中被广泛研究,并且普遍在耐热性中发挥重要作用,但是对于热激转录因子C类基因的功能研究却很少。对高羊茅C类热激转录因子进行研究十分有意义。本研究从高羊茅中克隆出一个C类Hsf:FaHsC1b,通过序列分析、亚细胞定位并在拟南芥中过表达来分析FaHsfC1b在不同非生物胁迫下的表达模式以及它对转基因拟南芥耐热性的影响,研究结果如下:1以OsHsfC1b(XP_015633152)为搜索请求,从高羊茅转录组数据库中获得一段1333 bp的核苷酸序列,经FGENESH程序预测,其开放阅读框(ORF)为744 bp,编码247个氨基酸。通过降落聚合酶链式反应(touch down PCR)技术扩增获得其全长编码序列,由序列比对和系统进化树分析可知该基因与其他物种中的HsfC1b有较高的相似度,故将此基因命名为高羊茅HsfC1b基因(FaHsfC1b,NCBI登录号为KY475613)。该基因具备C类Hsfs的基本结构,包括一个DNA结合区域、一个疏水的寡聚化结构域、一个核定位信号结构域。2构建了 FaHsfC1b-eGFP重组质粒,转入到拟南芥原生质体中观察到绿色荧光蛋白信号与DAPI(指示细胞核)信号完全重叠;同时,转基因拟南芥根尖细胞中也观察到相同的重叠情况,这说明FaHsfC1b蛋白定位在细胞核中。3对高羊茅进行非生物胁迫处理,结果显示FaHsyC1b表达量在热处理(45℃)、冷处理(4℃)、渗透胁迫处理(20%PEG-6000)、盐处理(150 mMNaCl)下均在48 h内显著提高。在热处理下叶片中FaHsfC1b在处理1 h即达到最高值,为对照的40倍,根部FaHsfC1b表达量在4 h开始缓慢攀升,最后在48 h达到最大值。4构建了 pEarleyGate103-FaHsfC1b表达载体并转入拟南芥,通过草铵膦筛选和PCR鉴定,得到20个阳性转基因株系。对平板中野生型(WT)和转基因株系进行高温(45℃)处理,根据存活率筛选出4个稳定的抗性株系,即株系5,株系6,株系16,和株系17。在FaHsfC1b过表达株系中检测到较高的FaHsfC1b表达量,而WT中则未检测到FaHsfC1b的表达。同时,这几个转基因株系在冷胁迫、渗透胁迫、盐胁迫下与WT无差异,在非胁迫条件下转基因株系的长势也与WT无异。5在热处理下,FaHsfC1b过表达植株比WT有更少的枯萎叶片,在恢复后叶片枯黄率更低。经检测,过表达株系光化学效率和叶绿素含量比WT更高,电解质渗漏率则比WT低,这说明过量表达FaHsfC1b可以将转基因拟南芥的代谢平衡和细胞膜稳定性维持在较高水平,从而提高转基因拟南芥耐热性。6热处理1 h后,通过DAB和NBT实验得知FaHsfC1b过表达植株叶片中ROS含量明显低于WT,说明转基因拟南芥在热处理下受到了较小的伤害。7 37℃ 热处理 1h 后,AtHHsp1 8.1-CI,AtHsp22.0-ER,AtHHsp26.5-P(r)和 AtHHsp70b基因的表达量在两个FaHsfC1b过表达株系(株系6和株系16)和WT株系中都显著提高,但过表达植株中表达量上升幅度更大。说明热激蛋白在转基因拟南芥植株耐热性中发挥了更好的作用。综上所述,从高羊茅中克隆到的C类热激转录因子FaHsfC1b定位于细胞核,响应热胁迫、冷胁迫、渗透胁迫以及盐胁迫。通过转化模式植物拟南芥,初步确定该基因通过对生理生化及下游基因的表达调控,提高植物耐热性。该研究为培育耐热草坪草新种质提供了基因资源。
【学位单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S688.4
【部分图文】：

２．２．３?ＦａＨｓｆＣｌｂ序歹丨此对和系统进化树分析??采用ＭＥＧＡ?５．１进行系统进化树分析表明，ＦａＨｓｆＣｌｂ与小麦、二穗短柄草、水稻、??玉米、粟（５Ｗｆｉｒｒ／ａ／／ａ／／ｃａ）中的ＨｓｆＣｌｂ都有较高的同源性（图２－３）。故将此基因命??名为高羊茅基因。并己在ＮＣＢＩ上进行注册，基因登录号为ＫＹ４７５６１３。根??据Ｂｉｏｅｄｉｔ软件氨基酸序列比对结果（图２－４）可知，该基因在靠近Ｎ端的部分有一个??ＤＮＡ结合区域（ＤＮＡ?ｂｉｎｄｉｎｇ?ｄｏｍａｉｎ，?ＤＢＤ），紧接着是一个疏水的寡聚化结构域??（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ?ｄｏｍａｉｎ，?０Ｄ），也叫作ＨＲ－Ａ／Ｂ区域，靠近Ｃ端是核定位信号结构??域（ｎｕｃｌｅａｒ?ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ?ｓｉｇｎａｌ，?ＮＬＳ）。??６２??？?ＦａＨＳＦＣＩｂ??９８?［Ｉ?ＴａＨＳＦＣＩｂ??４１Ｊ?Ｉ?ＢｄＨＳＦＣＩｂ???１?００?１?ＯｓＨＳＦＣＩｂ???ＺｍＨＳＦ３０????５ｇ１?ＳｉＨＳＦＣＩｂ???ＯｓＨＳＦＣＩａ???ＯｓＨＳＦＣ２ａ??，〇〇??ＯｓＨＳＦＣ２ｂ??图２－３?ＦａＨｓｆＣｌｂ与其他Ｃ类热激转录因子的系统进化树分析??Ｆｉｇ．?２－３?Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ?ｔｒｅｅ?ｏｆ?ＦａＨｓｆＣｌｂ?ａｎｄ?ｏｔｈｅｒ?ＨＳＦＣ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ??２５??

?Ｍａｒｋｅｒ??图２－２高羊茅片段凝胶电泳图??Ｆｉｇ．?２－２?Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＦａＨｓｆＣｌｂ?ｆｒｏｍ?ｔａｌｌ?ｆｅｓｃｕｅ??将上述克隆到的基因连接ｐＪＥＴｌ．２?ｂｌｕｎｔ?ｖｅｃｔｏｒ并用电击法转入大肠杆菌，将菌液??送测序公司确认目的片段序列。该片段ＯＲＦ全长７４４?ｂｐ，编码２４７个氨基酸，与之??前预测所得完全符合。??２．２．３?ＦａＨｓｆＣｌｂ序歹丨此对和系统进化树分析??采用ＭＥＧＡ?５．１进行系统进化树分析表明，ＦａＨｓｆＣｌｂ与小麦、二穗短柄草、水稻、??玉米、粟（５Ｗｆｉｒｒ／ａ／／ａ／／ｃａ）中的ＨｓｆＣｌｂ都有较高的同源性（图２－３）。故将此基因命??名为高羊茅基因。并己在ＮＣＢＩ上进行注册，基因登录号为ＫＹ４７５６１３。根??据Ｂｉｏｅｄｉｔ软件氨基酸序列比对结果（图２－４）可知，该基因在靠近Ｎ端的部分有一个??ＤＮＡ结合区域（ＤＮＡ?ｂｉｎｄｉｎｇ?ｄｏｍａｉｎ，?ＤＢＤ），紧接着是一个疏水的寡聚化结构域??（ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ?ｄｏｍａｉｎ，?０Ｄ），也叫作ＨＲ－Ａ／Ｂ区域，靠近Ｃ端是核定位信号结构??域（ｎｕｃｌｅａｒ?ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ?ｓｉｇｎａｌ

尖部分制作玻片，于共聚焦显微镜下观察，即可看到ＧＦＰ信号，再用ＤＡＰＩ染色液滴??入盛有根尖的载玻片，在显微镜下观察细胞核的位置，与ＧＦＰ信号比对后两者完全重??合（如图２－６），再次证明了?ＦａＨｓｆＣｌｂ的核定位。??ＧＦＰ?ＤＡＰＩ?Ｂｒｉｑｈｔ?ｆｉｅｌｄ?Ｍｅｒｑｅｄ??ｍｍ：：＇、：??图２－６乃＆尸转基因拟南芥ＦａＨｓｆＣｌｂ蛋白在根毛上的核定位??Ｆｉｇ．?２－６?Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＦａＨｓｆＣｌｂ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｉｎ?ｒｏｏｔ?ｈａｉｒ?ｏｆ?ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ?ｐｌａｎｔｓ．??在高倍放大镜下观察到的拟南芥根毛ＧＦＰ信号、细胞核与ＧＦＰ信号重叠情况。Ｂａｒ＝１０Ｍｍ。??Ｔｈｒｅｅ－ｄａｙ－ｏｌｄ?ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ?ｉｎ?ｃｕｌｔｕｒｅ?ｄｉｓｈ?ｗｅｒｅ?ｏｂｓｅｒｖｅｄ?ｕｎｄｅｒ?ｈｉｇｈｅｒ?ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．??Ｂａｒ＝１０?（ｉｍ．??２．２．５?在非生物肋、迫下的表达分析??将水培培养２周左右的高羊茅植株在４５°Ｃ、４°Ｃ、２０?％?ＰＥＧ－６０００及１５０?ｍＭ?ＮａＣｌ??条件分别处理４８ｈ，在Ｏｈ、ｌｈ、２ｈ、４ｈ、１２ｈ、２４ｈ、４８ｈ取样，提取总ＲＮＡ后，??反转录成单链ｃＤＮＡ。通过ｑＲＴ－ＰＣＲ检测在各种非生物胁迫下的表达情况，??以作为内参基因。ｑＲＴ－ＰＣＲ结果如图２－７所示，表达量在缺水处??理、盐处理、热处理、冷处理下均在４８?ｈ内显著提高，从的表达模式因不同??处理、不同组织部位而不同。??在热处理和冷处理下，高羊茅叶片中Ａ／＊／Ｃ乃比根部更早表现出表达??量的激增
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本文编号：2863401