桂花花瓣的类黄酮代谢途径及调控

发布时间：2020-11-02 11:02

　　 桂花(Osmanthus fragrans)隶属于木犀科木犀属(Osmanthus),又名九里香,是一种常绿阔叶的观赏性乔木,植株较矮,也是我国的传统名花之一。桂花在汉代就有人工种植的记载,在我国南方各省区均有野生和大面积人工种植的桂花。桂花具有独特的芳香气味,自古以来被广泛应用,如食品、香料、制茶、药用等。另外,桂花在我国文化中有着美好的象征意义。经过长时间的自然生长和人工栽培,桂花出现了许多不同的品种,分四个品种群:丹桂、银桂、金桂和四季桂。在桂花的长期进化过程中,通过产生各种类型的次生代谢产物,桂花逐渐形成了一些抵御外界不良环境的独特功能。这些次生代谢产物,在植物的整体代谢活动中占据着十分重要的地位,同时又能够留在植物体内以便抵御一些病原微生物等外界物质的侵害。本研究以银桂品种白洁和橙红丹桂盛花期的花瓣为材料,通过生理生化和分子生物学的方法,研究桂花的类黄酮代谢途径,主要研究结果如下:(1)利用分光光度法和高效液相色谱技术对白洁和橙红丹桂2个品种盛花期花瓣中总黄酮和槲皮素含量进行分析检测,比较这两种桂花品种花瓣中类黄酮和槲皮素积累量。通过检测结果发现,白洁花瓣中的类黄酮和槲皮素含量显著高于橙红丹桂。(2)利用RT-PCR和荧光定量PCR检测类黄酮代谢途径中相关基因的表达量,发现相比较橙红丹桂,白洁花瓣中类黄酮代谢途径上游基因PAL、CHS、F3H和FLS的表达量明显上调,而下游基因DFR和ANS表达量出现下调。这种基因表达量上的差异会导致白洁花瓣中类黄酮的积累。(3)构建35S-OfMYB1-GFP-NOS重组载体,转化农杆菌,侵染桂花花瓣,提取RNA后,用RT-PCR和荧光定量PCR检测类黄酮代谢途径中相关基因的表达量,结果显示:OfMYB1基因超表达后,促进了PAL、CHI、FLS基因表达量的上调,而基因DFR、ANS基因表达量出现了下调。说明OfMYB1可能调控了这些基因的表达。(4)酵母单杂交实验发现将pB42AD-ofMYB1和pLacZi-MBP重组质粒共转化酵母后,培养后,经过Z-buffer/X-gal染色后显蓝色,而对照共转化pB42AD和pLacZi-MBP重组质粒,经培养和显色后并不显蓝色,这一结果表明,OfMYB1能够与OfPAL基因启动子区域的MYBPLANT元件相互作用,说明OfMYB1可能参与了PAL基因表达的调控。(5)构建原核蛋白表达载体pET-30a-OfMYB1,转入BL21感受态细胞中,经培养和诱导后,提取蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳可以看到有25KD大小的OfMYB1蛋白目的条带,而且随诱导时间的延长,蛋白量明显增多。
【学位单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S685.13
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
1 绪论
    1.1 类黄酮研究进展
    1.2 类黄酮的基本结构和分类
    1.3 类黄酮的生物学功能
        1.3.1 类黄酮对植物本身的作用
        1.3.2 对人类健康的作用
    1.4 类黄酮次生代谢的基本途径
    1.5 类黄酮代谢过程中的酶
    1.6 转录因子
    1.7 酵母单杂交实验
    1.8 研究目的及意义
2 白洁和橙红丹桂类黄酮含量分析
    2.1 实验材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 实验试剂和仪器
    2.2 试验方法
        2.2.1 桂花花瓣中类黄酮的提取
        2.2.2 溶液的配制
        2.2.3 色谱条件
    2.3 结果与分析
        2.3.1 绘制芦丁标准线性方程
        2.3.2 桂花总黄酮含量测定
        2.3.3 槲皮素标准品标准曲线的绘制
        2.3.4 槲皮素含量的分析
    2.4 讨论
3 类黄酮代谢途径相关基因的表达分析
    3.1 实验材料
        3.1.1 植物材料处理
        3.1.2 实验试剂
        3.1.3 所用引物序列
    3.2 试验方法
        3.2.1 桂花花瓣RNA样品的提取
        3.2.2 RNA的反转录
        3.2.3 RT-PCR分析基因的相对表达量
        3.2.4 荧光定量的实验流程
    3.3 结果与分析
        3.3.1 RT-PCR分析类黄酮代谢途径中的相关基因表达量
        3.3.2 类黄酮代谢途径相关基因表达量的荧光定量PCR分析
    3.4 讨论
4 MYB1基因在白洁花瓣中超表达对类黄酮代谢途径基因表达的影响
    4.1 实验材料
        4.1.1 植物材料处理
        4.1.2 实验试剂
        4.1.3 菌株与质粒载体
        4.1.4 试剂和培养基的配制
        4.1.5 所用引物序列
    4.2 试验方法
        4.2.1 桂花花瓣RNA样品的提取
        4.2.2 RNA的反转录
        4.2.3 双链cDNA的合成
        4.2.4 扩增片段的回收
        4.2.5 35S-OfMYB1-GFP-NOS超表达重组载体的构建
        4.2.6 E.coli感受态细胞的制备与转化
        4.2.7 农杆菌感受态细胞的制备和转化
        4.2.8 侵染桂花实验流程
        4.2.9 RT-PCR的实验方法
        4.2.10 荧光定量PCR流程
    4.3 结果与分析
        4.3.1 35S-OfMYB1-GFP-NOS超表达重组载体的构建
        4.3.2 MYB1基因相对表达量的RT-PCR分析
        4.3.3 荧光定量PCR分析MYB1基因超表达对类黄酮代谢途径相关基因表达量的影响
    4.4 讨论
5 酵母单杂交试验验证MYB1调控PAL基因的功能
    5.1 实验材料
        5.1.1 植物材料
        5.1.2 质粒载体和菌株
        5.1.3 实验试剂
        5.1.4 实验溶液
    5.2 实验方法
        5.2.1 花瓣RNA的提取
        5.2.2 RNA的反转录
        5.2.3 元件的合成
        5.2.4 pLacZi-MBP重组质粒的构建
        5.2.5 pB42AD-ofMYB1重组质粒的构建
        5.2.6 酵母感受态的制备和转化
        5.2.7 酵母阳性克隆的筛选
    5.3 结果与分析
        5.3.1 空质粒pB42AD和空质粒pLacZi的酶切结果
        5.3.2 pB42AD-ofMYB1和pLacZi-MBP重组载体的构建
        5.3.3 酵母单杂交阳性克隆的显色
    5.4 讨论
6 OfMYB1转录因子的原核蛋白表达
    6.1 实验材料
        6.1.1 植物材料
        6.1.2 质粒载体与菌株
        6.1.3 溶液
    6.2 实验方法
        6.2.1 BL21 （DE3）感受态细胞的制备
        6.2.2 PET30a-OfMYB1重组载体的构建
        6.2.3 重组载体原核蛋白的诱导表达
        6.2.4 SDS-PAGE凝胶电泳、染色及脱色
    6.3 结果与分析
        6.3.1 pET30a-OfMYB1重组载体的构建
        6.3.2 PET30a-OfMYB1重组蛋白的表达
    6.4 讨论
结论
参考文献
致谢
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本文编号：2866961