土壤中干巴菌菌丝体测定及分析

发布时间：2020-11-08 15:51

　　 干巴菌(Thelephora ganbajun Zang),属担子菌门(Basidiomycota)、革菌科(Thelephoraceae)、革菌属(Thelephora),是云南省珍稀的野生食用菌,具有较高的营养价值和经济价值。目前对于干巴菌的报道大多集中在形态结构、干巴菌成分的分析、遗传差异以及生态效应方面,对于干巴菌基因和生长机理方面的研究甚少。本研究主要运用实时定量PCR技术来测定干巴菌生长的不同土壤深度和范围的菌丝体含量,从而探究干巴菌的生长和子实体形成机理。通过对干巴菌单拷贝基因和多拷贝基因测定土壤菌丝体含量的比较,探讨单拷贝基因和多拷贝基因测定土壤菌丝体的优缺点和可行性。本研究应用多拷贝基因实时定量PCR方法对云南常见的外生菌根真菌铜绿菌(Lactarius hatsudake)进行了土壤菌丝体含量的测定,发现干巴菌与铜绿菌在子实体形成过程中土壤的菌丝体含量及分布存在一定的差异性。本研究得出的主要结果如下:1、目前现有的单拷贝基因引物主要针对口蘑属,本研究摸索了其引物对干巴菌DNA的扩增,结果没有获得单一条带和有效序列,因此现有单拷贝基因引物不适用于干巴菌单拷贝基因的扩增。本研究通过基因组比较,找到了干巴菌的单拷贝基因,在此基础上设计并验证了特异性引物;通过比对铜绿菌与相近物种的ITS序列设计并验证了特异性引物。上述两对特异性引物的成功合成,为土壤中菌丝体含量的实时定量测定提供可实施的必要条件。2、多拷贝基因与单拷贝基因实时定量PCR测定方法的结果有成倍增加和减少的趋势大体一致,但也存在一定的差异。两种基因测得的干巴菌菌丝体含量,比值在1-29之间。少量样品比值差异性较大,倍数在1-3左右,而比值在5-16之间的占总数的57.14%。如果测定干巴菌菌丝体含量用来研究干巴菌菌丝体的分布状况,也可以考虑使用多拷贝基因来测定作为参考。3、根据实时定量PCR测定土壤菌丝体含量分析比较发现铜绿菌与干巴菌子实体形成的过程存在较大差异,土壤中干巴菌菌丝体分布不具菌塘规律性,铜绿菌菌丝体在土壤中分布具有一定的规律性。推断铜绿菌在子实体形成过程中,可能其菌丝侵入植物体根部,吸收根部的营养物质,菌丝体含量逐渐增多并在土壤中逐渐向外延伸,当土壤环境较为适合时,铜绿菌菌丝体逐渐聚集增多形成菌塘,从而形成子实体。4、通过观察发现干巴菌在子实体的形成过程中,其菌丝侵入松树等的根部,进入根部细胞间隙,然后向根外延伸形成二叉分支结构的菌根,而后菌根逐渐增多聚集,聚集到一定程度时形成子实体。在此过程中有少量菌丝体分散在土壤中,但不形成菌塘。根据这一特征,在干巴菌的人工栽培过程中,可以通过提高干巴菌侵染以及控制寄主松树的生长状况来实现,但还需进一步探索。
【学位单位】：云南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S646
【部分图文】：

２．１．３琼脂糖凝胶电泳及测序??取２＾ＬＰＣＲ产物在２％琼脂糖凝胶上电泳，ＧｅｎｅＦｉｎｄｅｒＴＭ染色，紫外透??射仪检测见图２。将有单一条带的ＰＣＲ产物送到昆明硕擎生物科技有限公司测??序，测序均未获得有效序列，见图２。??应用上述物种的单拷贝基因引物，均未成功扩增出干巴菌的相应基因片段。??１５??

Ｆｉｇｕｒｅ?４?Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ?ｍａｐ?ｏｆ?ｐａｒｔｉａｌ?ｐｒｉｍｅｒ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?ｓｉｎｇｌｅ?ｃｏｐｙ?ｇｅｎｅ?ｏｆ??Ｔｈｅｌｅｐｈｏｒａ?ｇａｎｂａｊｕｎ?Ｚａｎｇ??２．２．３干巴菌单拷贝基因的验证??割胶回收：准备Ａ６、Ａ１４、Ａ２８、Ａ４５、Ａ５０和Ａ５１这６对引物扩增的ＰＣＲ产??物，取２５卟ＰＣＲ扩增产物和５卟Ｕｎｌｏａｄｉｎｇ?ｂｕｆｆｅｒ混匀，２％的琼脂糖凝胶电??泳，ＰＣＲ产物回收时做割胶回收。具体回收具体步骤按照从云南晨绿生物科技??有限公司购买的天根ＤＮＡ纯化回收试剂盒（货号为：ＤＰ２１４）操作，把回收的??ＤＮＡ放到－２０°Ｃ保存备用。??ＤＮＡ片段两端连接腺嘌呤：由于ＰＣＲ试剂金牌ＭＩＸ扩增的基因片段两端没有??连接腺嘌呤，回收的ＤＮＡ片段两端需要加入腺嘌呤。反应体系为：回收产物??２２??

?云南大学硕士毕业论文???的甘油溶液（按照１：?５的比例加入），固定在摇床上１８０转３７°Ｃ培养１?ｈ，然??后放置于－２０＂Ｃ的冰箱中保存。??测序结果用ｓｅｑＭａｎ和ＢｉｏＥｄｉｔ软件进行比对，３０个插入载体中单克隆的序??列进行比对并与之前ＰＣＲ扩增序列及从基因组中挑选出来的原单拷贝基因序??列比对，序列完全相同的有：引物Ａ６、Ａ２８、Ａ５０和引物Ａ５１扩增的基因片段，??分别见图５、图６、图７和图８。因此引物Ａ６、Ａ２８、Ａ５０和引物Ａ５１均为干??巴菌单拷贝基因特异性引物。??＊ｅ－１?Ｇ：：：．?：?：?：?ｒａｒＣ／＾．－－ＧｒＡ?■?：ＧＧ＾ｒ３＊ＣＧＡ：?；?．?：?ｒＴＣＣ：Ｃ．?；?．?Ｔ?：?Ａ?久；《〇〇：．二〇；：－．｜１＊！：广－－－－：ｓ：?／ＧＧ：１：??Ａ４－２?ａ．－．?Ｃ?．３．?；；Ｇ５－．．－３；．ｔ５Ｃ；．?？－?．：?Ｇ?：．?：?．?：：■：．?．?．－３；．?．?．?Ｓ３３；．?ＡＣＣ?．?Ｊ－－?ＣＡ?；?：ｒ〇．?．?Ｃ?．?３?．?．Ｃｉ．：??－－＊＊＊－＇?■￣－＇
【参考文献】

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本文编号：2874996