硼是柑橘正常生长所必需的微量营养元素之一。缺硼已经严重制约了我国柑橘产量和品质的提高。柑橘砧木的生长状况在果树对养分的吸收和对逆境胁迫的适应能力等方面发挥着至关重要的作用。枳壳砧木(枳砧)[Poncirus trifoliata(L.)Raf.]作为我国柑橘的主栽砧木,对缺硼十分敏感,供硼不足时,根系是最早出现缺硼症状的部位。因此,进一步探讨枳砧根系伸长受阻、根尖膨大等缺硼症状与根系内部结构、细胞壁特性和物质代谢途径的内在联系,有助于理解硼在柑橘砧木上的生理功能,丰富硼营养理论。另外,缺硼的枳砧恢复正常供硼后根系代谢产物的响应研究,能够为柑橘砧木的科学合理施肥提供理论基础。本研究以枳砧实生苗作为试验材料,采用营养液培养方式,利用石蜡切片、透射电镜(TEM)、荧光显微镜(FM)、傅里叶红外光谱(FTIR)、~(13)C固体核磁共振(~(13)C-NMR)、荧光染料活体染色、非靶标代谢(GC-TOF-MS)和靶标代谢(UHPLC-MS/MS)技术,分析了缺硼对枳砧实生苗根系细胞壁物质组分及结构、细胞壁果胶特性、根尖细胞活性及结构、根系活性氧类物质(ROS)和莽草酸代谢途径中次级代谢产物的影响,并研究了对缺硼的植株恢复正常供硼不同时长后根系中代谢产物的响应差异。得到的主要研究结果如下:1缺硼胁迫下枳砧根尖微观结构和细胞活力特征缺硼显著抑制了枳砧幼苗的生长,并且对根系的影响更明显,侧根发育受阻,根尖短粗膨大。对枳砧根尖的FDA-PI活体染色结果表明,缺硼破坏了根尖细胞的细胞膜结构,细胞损伤严重,PI染料将细胞核染成红色;而正常硼处理的植株根尖细胞完整,在荧光显微镜下根尖呈绿色。缺硼胁迫下根系丙二醛(MDA)含量的显著升高也表征了细胞膜脂过氧化程度的加剧。缺硼还破坏了根尖解剖结构,表皮细胞排列紊乱,韧皮部细胞细胞核降解,细胞壁不规则增厚,液泡破裂,细胞间的黏附作用降低。对根尖ROS的荧光染色以及化学方法测定分析结果可知,缺硼时大量过氧化氢(H_2O_2)和超氧阴离子(O_2~(·-))在根系积累,虽然抗氧化酶(超氧化物歧化酶、愈创木酚过氧化物酶和过氧化氢酶)活性增强,但并没有完全清除多余的ROS,这也表明了缺硼对根系造成了氧化胁迫。2缺硼胁迫下枳砧根系细胞壁组分及果胶特性与对照相比,缺硼处理9周后枳砧幼苗根长和株高分别降低了64.86和46.35%,各部位的干物质积累量也显著降低。缺硼还降低了枳砧根系和根细胞壁中的硼含量,但细胞壁中结合的硼的比例显著升高,是对照的2.28倍,说明供硼不足条件下根系中的硼会优先分配到细胞壁中。根系TEM图像和细胞壁的提取及厚度测量结果表明,缺硼破坏了细胞结构,细胞壁明显增厚,缺硼根系细胞壁厚度是对照的1.82倍,细胞壁物质的量也显著增加。FTIR和~(13)C-NMR光谱揭示了缺硼胁迫下枳砧根细胞壁主要化学组分和有机碳结构的变化,缺硼改变了根细胞壁的有机碳组成结构和细胞壁中蛋白质结构,破坏了细胞壁大分子之间的连接模式,氨基酸、蜡质、纤维素、酚类物质和木质素含量升高。另外,与对照相比,缺硼时Na_2CO_3-可溶性果胶糖醛酸含量降低了34.09%,CDTA-和Na_2CO_3-可溶性果胶的KDO含量分别降低了21.59和31.92%。缺硼还提高了细胞壁果胶的甲基酯化度,尤其是CDTA-可溶性果胶,是对照的1.84倍。这些结果表明,缺硼时根系细胞壁中果胶网络结构和细胞壁组分的改变引起了细胞壁结构完整性的破坏,这可能是根系生长中断和根尖肿胀膨大的主要原因。3缺硼胁迫下枳砧根系的非靶标代谢组学和靶标代谢组学研究正常硼处理和缺硼处理的枳砧幼苗根系中代谢产物含量存在很大差异。在该研究选择的40种匹配度大于70%的代谢产物中,缺硼处理9周后根系中有10种代谢产物:β-丙氨酸(β-Ala)、丙氨酸(Ala)、糖酸、α-酮戊二酸、奎尼酸、富马酸、D-甘油酸、硬脂酸、棕榈酸和草酸含量降低,另外有30种代谢产物(10种主要氨基酸、8种糖类物质、6种有机酸、3种脂肪酸和3种其他物质)含量升高,这些代谢物的变化进而影响了枳砧根系中的代谢通路。这些改变反映了缺硼对根系中糖的利用和蛋白质合成的阻碍,以及三羧酸循环模式的变化。此外,缺硼促进了枳砧幼苗根系中莽草酸代谢途径的进行,根系中苯丙氨酸(Phe)和酪氨酸(Tyr)含量的升高促进了水杨酸、咖啡酸和阿魏酸的生物合成,缺硼还通过阻碍色氨酸(Trp)向3-吲哚乙酸(IAA)的转化抑制了生长素的生物合成,木质素上游物质咖啡酸和阿魏酸的增加也促进了木质素的积累。缺硼时这些代谢产物的变化对根系代谢网络结构中多种代谢途径的影响可能参与了根系结构和形态的改变。4恢复正常供硼后枳砧根系中代谢产物及代谢通路响应对缺硼的枳砧幼苗恢复正常供硼可以很大程度上逆转缺硼引起的代谢谱的改变。恢复供硼1周后脯氨酸(Pro),6-脱氧-D-葡萄糖,myo-肌醇和亚油酸就恢复到正常水平,说明这几种代谢产物对供硼十分敏感;半乳糖酸、硬脂酸和乌头酸供硼2周后恢复到正常水平,丝氨酸(Ser)、葡萄糖酸、乳糖、马来酸盐、草酸、植醇和亚麻酸这7种代谢物在供硼3周后恢复到正常水平;另外还有一些代谢物可能需要更长的供硼时间才能恢复至正常水平。说明虽然正常供硼可以使缺硼引起的一些代谢产物的改变得到有效恢复,但不同代谢产物的响应周期存在很大差异。另外,随着供硼时间的延长,根系侧根发育得到促进,生物量也显著升高。这些结果表明,对缺硼的枳砧幼苗供硼虽然能很大程度上缓解缺硼对根系中心代谢产物的影响并促进根系生长,但并不能完全逆转缺硼对它们的改变。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S666
【部分图文】：
4 1-1 聚鼠李糖半乳糖醛酸 II（RG-II）的糖基序列及其与硼的交联。（A）RG-II架含有 7 个 α-D-半乳糖醛酸残基和 4 条结构不同的寡糖组成的侧链；（B）两 RG-II 分子与硼的交联；（C）两分子的 RG-II 单体通过硼酸二酯键共价交联（Barpeled et al., 2012）。Fig. 1-1 The structure of RG-II and its cross-linking with B through boratediester bond. (A) The glycosyl sequence of RG-II. The backbone of 7 GalAsidues and 4 fully decorated side chains; (B) Cartoon showing the cross-linkingof two RG-II molecules; (C) The borate diester cross-link.
6图 1-2 硼在细胞壁和细胞膜中的作用（Marschner, 2012）。Fig. 1-2 The roles of boron in plant cell wall and membranes.
图 1-3 缺硼导致的柑橘叶片黄化和“石头果”。（姜存仓等，2009）Fig. 1-3 Leaf chlorosis and stone fruit rigidification of citrus induced byboron deficiency.
【参考文献】
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2881024
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