黄瓜低温胁迫与恢复过程中水苏糖合成酶与α-半乳糖苷酶在RFOs代谢中的作用

发布时间：2020-11-13 19:03

　　 黄瓜(Cucumis sativus L.)反季节栽培时经常遭遇低温胁迫,研究其低温响应机制将有助于创制黄瓜耐低温栽培和育种的新方法。积累棉籽糖家族寡糖(RFOs)是植物抵御低温胁迫的有效途径之一,前期研究表明,黄瓜作为一种RFOs运输型植物,低温同样会导致RFOs在叶片中积累,低温解除后RFOs含量又逐步恢复至正常水平。但是,在低温胁迫与解除过程中,RFOs合成与分解的生理过程并不清楚。水苏糖合成酶(STS,EC.2.4.1.67)和α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)分别是催化水苏糖合成与分解的关键酶。黄瓜叶片中存在3种不同的STS转录本和6种不同的α-半乳糖苷酶转录本,其中各STS转录本由同一基因编码、通过选择性剪切生成;而各α-半乳糖苷酶转录本则是由6个不同的基因所编码。在低温胁迫与解除过程中,这些转录本在RFOs合成与降解中的具体作用目前不清楚。为此,本试验首先建立了特异鉴定3种STS转录本的方法,探明了这3种转录本的稳定性及其受胞内糖水平调节表达的特点,并在此基础上研究了 STS与α-半乳糖苷酶各种转录本在黄瓜低温胁迫与解除过程中的表达、酶活性及相关糖含量的变化。此外,前期研究表明黄瓜低温胁迫后RFOs在液胞、细胞质、叶绿体中均有积累,低温解除后各亚细胞空间中的RFOs水平均逐步下降至正常水平。为探索各亚细胞空间中的RFOs分别由哪种α-半乳糖苷酶分解,本实验还研究了各种α-半乳糖苷酶亚细胞定位。所得结果如下:1.本试验建立的“3碱基锚定引物法”可特异鉴定3种STS转录本,保证在实时荧光RT—PCR反应中特异地区分3种转录本,为后续研究提供了有效实验手段。2.黄瓜愈伤组织STS的表达丰度显著低于叶片。黄瓜愈伤组织转至无糖MS培养基后,3种STS转录本的表达量上升;将愈伤组织从无糖培养基再转入蔗糖、棉籽糖、水苏糖、半乳糖为碳源的MS培养基中,3种STS转录本的表达量下降;表明STS各转录本的表达受细胞内糖水平的调节。放线菌素D抑制实验结果表明,STS Ⅱ转录本的稳定性显著低于其他2种转录本。3.黄瓜叶片中STSⅠ、STS Ⅱ的表达丰度显著高于STS Ⅲ,在黄瓜低温适应过程中起主导作用。4℃低温胁迫后,黄瓜叶片中各可溶性糖含量上升,3种STS转录本表达上调,酶活性提高。结合愈伤组织的研究结果,表明该上调确为低温所诱导,而不是糖水平上升所导致。恢复至常温后,各可溶性糖含量下降,酸性α-半乳糖苷酶3基因(GAL3)、碱性α-半乳糖苷酶2和3基因(AGA2,AGA3 的表达上调,GAL和AGA活性上升,表明这3个基因在温度恢复后RFOs降解过程中起重要作用。4.亚细胞定位研究结果表明,GAL1与GAL2定位于细胞壁;GAL3主要分布于液胞;AGA1和AGA2主要分布于细胞质;AGA3则定位于叶绿体。结合前期研究结果,表明低温解除后,GAL3、AGA2,AGA3分别在液胞、细胞质和叶绿体中起降解RFOs的作用。
【学位单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S642.2
【部分图文】：

‘?：；??图２．２?５ＴＳ质粒ＤＮＡ电泳图??Ｆｉｇ?２．２?ＳＴＳ?ｐｉａｓｍｉｄｓ?ＤＮＡ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｅｒｏｇｒａｍ??注：ｈ?５７＾／质粒ＤＮＡ；?２：?５Ｔ５７／质粒ＤＮＡ；?３：?５７５／／／质粒ＤＮＡ；??Ｎｏｔｅ：?１：?５７５／ｐｉａｓｍｉｄｓ?ＤＮＡ；?２：?５Ｔ５／／ｐｉａｓｍｉｄｓ?ＤＮＡ；?３：?ＳＴＳ?ＩＩＩ?ｐｉａｓｍｉｄｓ?ＤＮＡ??２．２．１．２水苏糖合成酶质粒ＤＮＡ线性化??由图２．３可知，水苏糖合成酶质粒经５＾１单酶切，所得条带与预期大小（６０５５，?６１２０，??６１９２）接近，可进行下一步实验操作。??姻??图２．３水苏糖合成酶质粒线性化??Ｆｉｇ?２．３?Ｓｔａｃｈｙｏｓｅ?ｓｙｎｔｈａｓｅ?ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ?ｐｌａｓｍｉｄ?ＤＮＡ??Ｍ：标准ＤＮＡ分子量；１：未酶切质粒ＤＮＡ；?２：?ＳＴＳ／质粒酶切；３：?ＳｒＳ／／质粒酶切；４：?５ＴＳ／／／??质粒酶切??Ｍ：?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；?１?：?Ｕｎｄｉｇｅｓｔｅｄ?ｐｌａｓｍｉｄ?ＤＮＡ；?２：?Ｓｉｎｇｌｅ?ｅｎｚｙｍｅｓ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＳＴＳ?／；?３：?Ｓｉｎｇｌｅ??ｅｎｚｙｍｅｓ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＳＴＳ?ＩＩ；?４：?Ｓｉｎｇｌｅ?ｅｎｚｙｍｅｓ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＳＴＳ?ＩＩＩ??２．２．１．３体外转录??参照?Ｔ７?ＲｉｂｏＭＡＸ？?Ｅｘｐｒｅｓｓ?Ｌａｒｇｅ?Ｓｃａｌｅ?ＲＮＡ?Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ?Ｓｙｓｔｅｍ?（?Ｐｒｏｍｅｇａ）说明书，??得到沉？／、５ＴＯ／／、见Ｓ／／／效好较好

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２．２．２实时逄＿锚定引物特异性验证??２．２．２．１?＊ＳＴ５７反转录引物的特异性验证??由图２．４可知，以沿＾／／为模板，以＊ｓｒｓ／－Ｒ为引物反转录，用＊ＳＪ１Ｓ荧光定量引物进行??ＰＣＲ，无条带；以灯以／／为模板，以ＳｒＳＺ－Ｒ为引物反转录，用见？荧光定量引物进行ＰＣＲ，??无条带；以灯Ｓ／为模板，以Ｗ－Ｒ为引物反转录，用荧光定量引物进行ＰＣＲ，有条??带且与预期大小一致（ｉ５８ｂＰ）。由此可证明引物■ｓｒｓｙ－Ｒ的特异性。??２５〇－??图２．４?反转录引物的特异性验证??Ｆｉｇ．２．４?Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＳＴＳ?１?ＲＴ－ｐｒｉｍｅｒ??注：Ｍ：标准ＤＮＡ分子量；１：?ＳｒＳ／Ｊ为模板；２：?Ｓｒａ／／／为模板；３：?为模板??Ｎｏｔｅ：?Ｍ：?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ；?１：?ＳＴＳ?ＩＩ?ａｓ?ａ?ｔｅｍｐｌａｔｅ；?２：?ＳＴＳ?ＩＩＩ?ａｓ?ａ?ｔｅｍｐｌａｔｅ；?３：?ＳＴＳ?／?ａｓ?ａ?ｔｅｍｐｌａｔｅ??２．２．２．２?＾７３７／反转录引物特异性验证??由图２．５可知，以ｓｒｓ／为模板，以■Ｓ７１Ｓ／／－Ｒ为引物反转录，用ｓｒｓ荧光定量引物进行??ＰＣＲ，无条带；以ｓｒａ／／／为模板，以Ｓ；ＴＳ／／－Ｒ为引物反转录，用■ＳＨ荧光定量引物进行??ＰＣＲ，无条带；以Ｓｒａ／／为模板，以见Ｓ／／－Ｒ为引物反转录，用荧光定量引物进行ＰＣＲ，??有条带且与预期大小一致（１５８ｂｐ）。可证明引物Ｓ７Ｓ／／－Ｒ的特异性。??Ｍ?１?２?３??遽Ｓ１終麗，??
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本文编号：2882519