苹果果糖激酶基因MdFRK2在调控糖代谢中的功能研究

发布时间：2020-11-19 16:21

　　 植物中可溶性糖——包括蔗糖、葡萄糖和果糖,不仅作为信号物质调控着成千上万基因的表达,影响着植物生长、发育及对逆境的抗性,也调控着胞内渗透势、膨压和氧化还原势,且可溶性糖的种类和组成也会影响苹果等水果的品质。苹果作为蔷薇科代表果树,由于其长距离运输的同化物以山梨醇为主,山梨醇在库细胞中全部转化为果糖进入碳代谢。因此,与其它植物相比,苹果中具有更高效的果糖利用能力。探明苹果中果糖高效代谢利用的调控机制,对于果实品质的改良和生长发育的调控有重要意义。为此,本文结合苹果基因组筛选了在库细胞中高度表达的果糖代谢相关的果糖激酶基因MdFRK2,研究了其表达及催化特性,获得了转基因苹果等,研究了其在糖代谢调控中的功能。获得的主要结果如下:1.在苹果基因组中共鉴定到了12个MdFRK同源基因,其中MdFRK2与番茄高亲和力果糖激酶LeFRK2亲缘关系最近,其ORF全长990bp,编码330个氨基酸,属于pfkB家族,并且含有FRK特有的糖结合域和ATP结合域。表达分析显示,MdFRK2基因主要定位于细胞质中,在苹果茎尖、幼果等代谢活跃的库器官中高度表达,与果实发育过程中果糖的含量呈显著负相关。为研究其催化特性,纯化获得了在大肠杆菌中异源表达的MdFRK1和MdFRK2蛋白,活性分析表明,二者对果糖有高度的底物特异性,且活性受高浓度果糖的反馈抑制。对其动力学酶活性研究发现,MdFRK2蛋白(Km=0.1 mm)对果糖的亲和力显著高于MdFRK1蛋白(Km=0.62 mm),但二者有相似的最大催化活性。这些结果表明,苹果中果糖的高效利用与MdFRK2的高度表达及对果糖高的催化能力有关。2.为了证实MdFRK2基因对苹果果糖含量及糖代谢路径的影响,构建了植物过表达载体,利用农杆菌介导法转化‘嘎啦’苹果,经分子和酶活性鉴定,获得了3个MdFRK2基因过表达的阳性转基因植株,其MdFRK2的mRNA和蛋白表达量均显著上调,且FRK酶活性增加。在培养箱种植的3月龄的转基因植株的净光合速率和生长与野生型无明显区别。对糖含量的测定发现,转基因苹果苗叶片中不仅果糖含量显著降低,且葡萄糖、蔗糖的含量均低于野生型植株。对其蔗糖含量下降原因的研究表明,转基因苹果中果糖代谢加快后,山梨醇合成关键酶A6PR及代谢的关键酶SDH酶活显著增加,而蔗糖合成关键酶SPS及代谢关键酶NINV和SUSY酶活显著降低,导致蔗糖和葡萄糖含量降低。这些结果表明MdFRK2基因调控苹果中果糖的含量,且苹果叶片能通过改变山梨醇和蔗糖代谢调控糖的含量。同时,对MdFRK2过表达的转基因番茄的研究也表明,MdFRK2过表达增加了番茄果实中FRK的活性,降低了果糖、葡萄糖和蔗糖的含量。3.由于MdFRK2过表达的转基因苹果中的糖含量变化趋势与褪黑素处理的苗子中糖含量变化趋势相反,我们推测MdFRK2表达与褪黑素信号之间存在密切的关联。为探明FRK2表达与褪黑素介导的糖积累之间的关系,我们用褪黑素处理野生型和MdFRK2过表达的转基因苹果苗。研究发现,高浓度褪黑素处理后,野生型苹果苗叶片中MdFRK2的转录和FRK活性受到抑制,果糖、葡萄糖和蔗糖含量显著增加,苗子生长受到抑制。在烟草叶片中瞬时转化MdFRK2基因启动子也证实MdFRK2的表达受高浓度褪黑素的抑制。但高浓度的外源褪黑素处理MdFRK2转基因苗并不能引起叶片中果糖、葡萄糖及蔗糖的大量积累,苗子的生长也没有受到明显抑制。以上结果表明MdFRK2基因表达参与了高浓度褪黑素介导的糖积累和生长抑制效应。4.将培养箱中的转基因苹果小苗移栽至温室一年后,再次测定糖含量发现,转基因苹果苗叶片中的果糖、葡萄糖和蔗糖含量不但没有下降,反而显著升高。进一步分析表明,转基因苹果叶片中MdFRK2表达仍然增加了24-45倍,但FRK活性表现出显著下调趋势,参与糖代谢的关键基因表达(如MdSDH1,MdSPS1,MdSUSY2)和酶活性(如SDH,SPS和SUSY)表现出与幼苗期完全相反的变化趋势。这些结果表明MdFRK2蛋白发生了翻译后修饰,且进一步证实了由MdFRK2决定的FRK活性调控着细胞内的糖信号以及代谢。我们通过高通量测序对转基因苹果中果糖恢复稳态的调控机制进行研究,转基因苹果中存在的差异表达基因共477个,包括41个蛋白质水平调控相关的基因,这些蛋白功能的进一步解析有望探明苹果中果糖信号的调控机制。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S661.1
【部分图文】：

FRKs 可能和植物应对非生物胁迫响应相关。在玉米中，短期的盐 FRK2 基因表达上调（Zorb et al. 2010）；在向日葵中，干旱胁迫导致 FRK 蛋谢相关的蛋白表达共同上调（Fulda et al. 2011）；甜菜根中，FRK 活性随着长而增加（Klotz et al. 2006）；在缺氧的条件下，水稻的两个 FRK 同工酶却活性，其中 OsFRK2 表达上调，但是 OsFRK1 表达下调（Guglielminetti et al. 2（2016）研究山梨醇和蔗糖在苹果抵抗干旱胁迫中的作用发现，干旱胁迫下中与糖代谢有关的大部分基因表达量上调，其中包括 MdFRK2 基因。 苹果中糖代谢研究进展.1 苹果糖代谢特点苹果中光合产物主要以山梨醇形式存在，约占总光合产物的 80%左右，其次约占总光合产物的 20%（图 1-1）。这两种物质在源叶中合成后，一部分用于所需的碳骨架，一部分作为代谢底物被氧化分解提供能量，其余大部分通过管-伴胞复合体运输到果实、茎尖等库器官中进行代谢（图 1-2，邓丽莉和生; Li et al. 2016）。

图 1-2 苹果库器官中的糖代谢及利用途径（Li et al. 2012）Fig. 1-2 Metabolism and utilization of carbohydrate in apple fruit.醇代谢山梨醇广泛存在于叶片、叶柄、韧皮部、茎、根、种子和果实其在成熟叶片中含量非常高，而在果实中含量远低于叶片，仅Josef 2004）。叶片中高的山梨醇含量有利于向果实中的转运，果葡萄糖浓度是由于叶片中山梨醇的转运导致（梁东 2010）。光合碳代谢形成的磷酸丙糖被位于叶绿体被膜上的磷酸丙糖转运，并经过几种酶解后生成果糖-1,6-二磷酸（FBP），胞质中的FBPase）催化果糖-1,6-二磷酸分解为 6-磷酸果糖（Fructose-6-p酸。6-磷酸果糖可逆的转化为 6-磷酸葡萄糖（Gucrose-6-phospha糖在 6- 磷酸山梨醇脱氢酶（ S6PDH ）的催化下生成 6- 磷phosphate，S6P），而后经 6-磷酸山梨醇磷酸酯酶（Sorbitol-6SorPP）脱磷生成山梨醇（梁东 2010; Zhou et al. 2004; Aprea et a成的大部分山梨醇经过长距离运输到库器官中进行卸载。在苹

9 MdFRK 蛋白活性检测测定方法参照 Renz（1993），1 ml 的反应体系包括 50 mM Tris-HCl（pH 8.0MgCl2， 2.5 mM ATP ， 0.33 mM NAD+， 1 U G6P dehydrogenase ，phoglucoisomerase，25 μL 纯化蛋白，最后加入 200 ul 不同浓度（0-8 mM）的反应。30℃水浴 5 min，340 nm 下测定吸光值。 结果与分析1 MdFRK2 基因的克隆和序列分析利用前人报道的番茄 LeFRK2 序列在苹果基因组数据库中搜索，与其同源度列编号为 MD04G1042400。据此，本试验克隆了 MD04G1042400 的开放阅RF），命名为 MdFRK2。通过 DNAMAN 软件将测序结果与苹果基因组中预序列进行核酸序列比对，其一致性高达 95.93%，表明克隆到的基因即为正RK2 基因（图 2-1）。MdFRK2 基因的 ORF 全长 990 bp，编码 330 个氨基酸残苹果基因组的第 0 号染色体上，含有 4 个外显子和 3 个内含子，全长 3124 b。
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本文编号：2890218