VaWRKY12和VaWRKY14调控山葡萄低温或干旱应答的机理研究

发布时间：2020-11-19 17:38

　　 葡萄(Vitis vinifera L.)是世界范围内一种重要的果树作物。我国北方葡萄主产区冬季寒冷干旱,主栽的欧亚种抗寒旱性较差,需要埋土才能安全越冬。此外,晚霜或早霜等低温引起的冷害和冻害也造成葡萄新芽和嫩枝的伤害,从而影响葡萄果实的品质与产量。因此,深入研究葡萄抗寒旱的分子机理,对培育抗寒旱的葡萄新品种,具有重要的理论和实际意义。前期研究发现,葡萄中多个WRKY基因能够快速响应低温胁迫,表明它们可能参与了葡萄的抗寒调控。本研究以高抗的山葡萄为材料,克隆了VaWRKY12,对其在不同胁迫条件下的表达模式及亚细胞定位进行了分析,并通过在拟南芥和山葡萄愈伤组织中过表达VaWRKY12,对其抗性功能及可能调控的下游基因进行了研究。同时,通过构建酵母双杂交文库筛选可能与VaWRKY12互作的蛋白。此外,本研究同时克隆了VaWRKY14基因,分析了其在不同胁迫下的表达模式与亚细细胞定位,并通过在拟南芥中过表达VaWRKY14分析其抗性功能及下游调控。取得的主要研究结果如下:1、在山葡萄中克隆了VaWRKY12基因,序列分析结果显示VaWRKY12蛋白含有一个完整的WRKY结构域,其C端含有一个C_2H_2锌指结构,属于WRKY IIb亚家族。VaWRKY12能够响应低温胁迫,随着冷处理时间的延长表达量持续上调,同时VaWRKY12能够不同程度地响应外源ABA、SA和GA的处理。2、VaWRKY12蛋白序列C端含有一段跨膜区(TM)。利用拟南芥原生质体转化系统和烟草瞬时转化系统进行研究表明,正常条件下VaWRKY12全长蛋白同时分布在细胞质和细胞核,在低温及其他胁迫条件下全部定位在细胞核,而去掉TM区的VaWRKY12截短蛋白在正常条件下全部定位于细胞核。由此可以推论,TM区影响VaWRKY12在细胞内的定位,胁迫后VaWRKY12可能会向细胞核转移。3、构建了基于35S启动子的VaWRKY12过表达载体,过表达VaWRKY12后拟南芥植株的抗寒性显著高于野生型。低温条件下过表达VaWRKY12能够提高植株中SOD的酶活,降低体内活性氧H_2O_2和O_2~-的积累,表明VaWRKY12通过增加植株的抗氧化能力来增强植物的抗寒性。4、过表达VaWRKY12的山葡萄愈伤其抗寒性显著高于空载对照。低温处理下过表达VaWRKY12愈伤中大量与胁迫相关的基因上调表达,其中包括ROS清除相关的谷胱甘肽转移酶(GST)基因和POD基因。这些结果表明VaWRKY12可能通过影响ROS的清除来调控葡萄的抗寒性。5、以VaWRKY12为诱饵蛋白进行互作蛋白的筛选,共得到10个候选的互作蛋白,其中包括2个泛素相关蛋白和2个钙调结合蛋白,这些蛋白可能通过与VaWRKY12的相互作用来调控葡萄的抗寒性。6、VaWRKY14基因序列分析结果表明VaWRKY14属于WRKY IIa亚家族基因。拟南芥原生质体转化系统发现VaWRKY14蛋白定位在细胞核。VaWRKY14能够响应低温和干旱胁迫及外源SA和ABA的处理。过表达VaWRKY14能够显著提高拟南芥的抗旱性。同时,过表达VaWRKY14拟南芥在干旱条件下抗氧化活性(CAT、POD和SOD)高于野生型植株。RNA-Seq结果显示过表达VaWRKY14后拟南芥中大量与胁迫相关基因的表达量上调。
【学位单位】：中国科学院大学(中国科学院武汉植物园)
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S663.1
【部分图文】：

山葡萄中VaWRKY12基因编码区的扩增

VaWRKY12蛋白同源性比对与聚类分析

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【参考文献】

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本文编号：2890273