‘云香’水仙WRKY转录因子的克隆及功能研究

发布时间：2020-11-21 22:36

　　 中国水仙(Narcissus tazetta var.chinensis)是石蒜科水仙属植物,我国十大传统名花之一。但中国水仙根为肉质须根,生长发育期需水量大,且可用于栽种水仙的良田大幅减少,因此,研究中国水仙应对干旱、盐碱等逆境胁迫应答过程,对拓宽水仙用途,扩大其栽种地域具有重要意义。本研究主要分为三个部分:第一部分为'云香'水仙非生物胁迫相关WRKY基因的克隆;第二部分主要检测'云香'水仙WRKY基因的组织特异性表达、时空特异性表达以及外源植物激素处理、非生物胁迫处理后的表达特征;第三部分为'云香'水仙WRKY基因过表达的转基因烟草的抗旱和抗盐能力初步分析。本研究结果为选育抗逆性的水仙新品种提供理论依据。主要研究结果如下:1.本研究基于课题组前期对'云香'水仙不同花期花瓣和副冠的转录组数据库,利用RT-PCR技术克隆了NtWRKYY1(GenBank登录号为 KX056495)和 NtWRKYY2(GenBank 登录号为 KX056496)基因,对其进行初步的生物信息学分析。氨基酸基本理化性质分析表明NtWRKYY1蛋白为酸性且不稳定的疏水性蛋白,NtWRKYY2蛋白为碱性且不稳定的亲水性蛋白。这2个蛋白为非分泌蛋白和非跨膜蛋白,以丝氨酸修饰为主导、苏氨酸或酪氨酸为辅的磷酸化修饰方式。亚细胞定位预测表明这2个蛋白定位在细胞核的可能性较大。序列比对和系统发育树分析表明NtWRKYY1基因属于Ⅱc类WRKY转录因子,NtWRKYY2基因属于Ⅱd类WRKY转录因子。2.实时荧光定量PCR结果表明NtWRKYY1和NtWRKYY2基因在'云香'水仙花中表达量显著高于根和叶,具有明显的组织特异性;时空表达分析结果表明在开花过程中的花瓣和副冠上NtWRKYY1和NtWRKYY2基因的转录水平基本呈现逐渐上升趋势,推测NtWRKYY1和NtWRKYY2基因可能参与'云香'水仙花朵衰老的过程;外源生长调节物质处理'云香'水仙叶片后的表达特性表明NtWRKYY1基因的表达受ABA诱导和MeJA抑制,而NtWRKYY2基因的表达受ABA、MeJA诱导;非生物胁迫处理'云香'水仙叶片后的表达特性表明NtWRKYY1和NtWRKYY2基因的表达可能受高温、干旱、盐的诱导。3.利用In-Fusion克隆技术构建了 pMDC140-NtWRKYY1和pMDC140-NtWRKYY2过表达载体,采用农杆菌介导的叶盘法进行烟草的遗传转化,通过PCR和GUS染色鉴定证明WRKY基因已经导入烟草基因组中,分别获得了转NtWRKYY1基因烟草T0代阳性苗3株,转NtWRKYY2基因烟草T0代阳性苗8株,收获T0代阳性苗种子后播种获得T1代阳性苗,对T1代转基因植株进行干旱和盐胁迫处理,结果显示,NtWRKY11和NtWRKYY2过表达的转基因烟草叶片萎蔫与黄化程度明显小于野生型烟草,研究表明NtWRKYY1和NtWRKYY2基因过表达的转基因烟草具有抵抗干旱和盐胁迫的能力。该研究为水仙抗旱和抗盐转基因育种提供备选目的基因,为进一步筛选WRKY候选基因转化水仙,以培育抗旱和抗盐性强,适应性广的中国水仙新品种奠定工作基础。
【学位单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：Q943.2;S682.21
【部分图文】：

３结果与分析??３．１?‘云香’水仙花瓣ＲＮＡ提取的质量??‘云香’水仙花瓣提取的ＲＮＡ，经琼脂糖凝胶电泳检测结果显示（图２－１），??出现２８Ｓ、１８Ｓ两条明显的条带，且２８ＳＲＮＡ亮度约为１８ＳＲＮＡ的２倍，整体??条带清晰整齐，无ＤＮＡ污染，无拖尾弥散现象，这表明所提取的ＲＮＡ未发生??降解，具有较好的完整性。紫外分光光度计检测，样品ＲＮＡ的ＯＤ２６０ｍＷ２８０ｎｍ??介于１．８－２．０之间，ＯＤ２６０ｎｍ／２３０ｎｍ均大于２．０，这表明所提取的ＲＮＡ无蛋白质、??其他有机物、其他小分子物质的污染

?葡恪??桑祝遥耍倩?虻目寺〖吧?镄畔⒀Х治觯崳?３．２?‘云香’水仙ＭｔＳＴ基因的克隆与序列分析??ＰＣＲ结果（图２－２）显示，以‘云香’水仙盛花期花瓣ＲＮＡ逆转录成的??ｃＤＮＡ为模板，用特异引物进行ＰＣＲ反应，扩增得到的产物与预期基因片段大??小一致。测序结果表明，２条基因的开放阅读框（ＯＲＦ）分别为５１０ｂｐ、８６７ｂｐ，??共编码１６９、２８９个氨基酸，将２个基因依次命名为ＭＰｍｒｍ、??ＧｅｎＢａｎｋ?登录号分别为?ＫＸ０５６４９５、ＫＸ０５６４９６。??Ｍ．?ＤＬ２０００；?ｌ．ＮｔＷＲＫＹＹｌ－，?２．ＭＷＲＫＹＹ２；??图２－２?‘云香’水仙ＮｔＷＲＫＹＹ?１、ＮｔＷＲＫＹＹ２基因的克隆??Ｆｉｇ．?２－２?Ｃｌｏｎｉｎｇ?ｏｆ?ＮｔＷＲＫＹＹｌ?？ｉｎｄＮｔＷＲＫＹＹ２?ｇｅｎｅｓ?ｆｒｏｍ?Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ?ｔａｚｅｔｔａ?ｖａｒ．?＇Ｙｕｎｘｉａｎｇ５??３．３?‘云香’水仙ＷＲＫＹ转录因子的蛋白结构分析??３．３．１氨基酸基本理化性质分析??氨基酸基本理化性质分析结果表明（表２－７），ＮｔＷＲＫＹＹｌ蛋白和??ＮｔＷＲＫＹＹ２蛋白的氨基酸数、相对分子质量、等电点、分子式、不稳定系数以??及疏水性均各不相同，说明这２个蛋白可能具有不同的功能。ＮｔＷＲＫＹＹｌ蛋白??的等电点小于７．００，不稳定系数大于４０，疏水性为正值，说明该蛋白为酸性且??不稳定的疏水性蛋白。ＮｔＷＲＫＹＹ２蛋白的等电点大于７．００

第二章‘云香’水仙ＷＲＫＹ基因的克隆及生物信息学分析??ＷＲＫＹＧＱＫ基序，Ｃ端锌指结构域为Ｃｘ４Ｃｘ２３ＨｘＨ型，是ＩＩ类ＷＲＫＹ转录因子。??利用ＭＥＧＡ５．２软件构建了ＮｔＷＲＫＹＹｌ与拟南芥中＾类ＷＲＫＹ转录因子的蛋??白系统进化树，结果显示（图２－８）?ＮｔＷＲＫＹＹｌ与ＡｔＷＲＫＹ５７聚在一起，进一??步说明基因属于ＩＩ?ｃ类ｗｒｋｙ转录因子。??
【参考文献】

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本文编号：2893704