细叶百合LpNAC6和LpNAC20基因的克隆及其在烟草中的抗盐功能分析

发布时间：2020-11-23 09:15

　　 细叶百合(Lilium pumilum)是一种分布范围极广的百合属多年生草本植物,其适应能力强,观赏价值高,具有较强的抗逆性,是百合抗性育种的重要亲本。NAC家族是植物最大的转录因子家族之一,受多种生物和非生物胁迫诱导,不少研究已经证实NAC转录因子参与了植物发育、生长调节以及逆境应答等各个方面。本研究以实验室前期获得的细叶百合转录组数据作为依据,筛选出候选基因,以细叶百合鳞茎为材料克隆得到LpNAC6和LpNAC20基因,对其进行生物信息学和基因表达模式分析;利用农杆菌介导法转化烟草,获得转基因烟草株系;通过转基因烟草鉴定LpNAC6和LpNAC20的过表达是否响应盐胁迫,从而为细叶百合NAC基因的进一步应用奠定基础。具体研究结果如下:1.采用同源克隆技术成功克隆细叶百合LpNAC6和LpNAC20基因,其中LpNAC6基因长度909bp,编码302个氨基酸,LpNAC20基因长度1986bp,编码661个氨基酸。保守结构与分析显示,LpNAC6和LpNAC20基因均为NAC转录因子。荧光定量PCR的方法分析LpNAC6和LpNAC6和LpNAC20基因在各种非生物胁迫(高盐、干旱、低温和ABA)下的表达情况,发现LpNAC6和LpNAC20对高盐和干旱胁迫比较敏感。2.成功构建了中间载体pMD18-T-LpNAC6和pMD18-T-LpNAC20;双酶切后和植物表达载体pBI121-GFP连接构建植物表达载体pBI121-LpNAC6-GFP和pBI121-LpNAC20-GFP;利用基因枪法完成LpNAC6和LpNAC20基因在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位分析,结果显示LpNAC6和LpNAC20基因均在细胞核中表达;利用农杆菌介导法将LpNAC6和LpNAC20基因成功整合到烟草基因组中并表达;根据转LpNAC6和LpNAC20基因烟草T0代植株的表型强弱,各选出三个株系LpNAC6-2、LpNAC6-3、LpNAC6-5和LpNAC20-4、LpNAC20-6、LpNAC20-9,将它们的种子播种在选择压为50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上进行筛选,获得转基因T1代植株。3.分别观察转LpNAC6和LpNAC20基因和野生型烟草种子在盐胁迫下的萌发率和幼苗生长情况。结果表明,盐处理下转基因LpNAC6和LpNAC20株系均表现出一定的耐受能力,种子萌发率和相对根长都大于野生型烟草。将成熟烟草植株(5～6片叶子)用300mmol/L NaC1处理15d后,野生型烟草出现黄化萎蔫及生长阻滞现象,而LpNAC6和LAC20基因过表达的转基因烟草仍然正常生长,且转基因植株的叶绿素、脯氨酸、可溶性蛋白的含量和超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶的活性均高于野生型植株。证明LpNAC6和LpNA0基因在烟草中的过表达能够增强其对盐肋迫的耐受性。
【学位单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S682.29
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 绪论
    1.1 课题背景
    1.2 植物转录因子参与响应逆境胁迫的研究
    1.3 关于NAC转录因子的研究进展
        1.3.1 NAC转录因子的功能研究
    1.4 细叶百合的研究进展
    1.5 研究的目的及意义
2 细叶百合LpNAC6、LpNAC20基因克隆及序列分析
    2.1 实验材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 主要试剂及菌株
        2.1.3 主要仪器设备
        2.1.4 相关培养基及试剂的配制
    2.2 实验方法
        2.2.1 细叶百合的总RNA的提取与鉴定
        2.2.2 细叶百合cDNA的合成
        2.2.3 LpNAC6和LpNAC20基因的克隆
        2.2.4 生物信息学分析
        2.2.5 细叶百合两个NAC基因在非生物胁迫下的荧光定量分析
    2.3 结果与分析
        2.3.1 总RNA电泳检测
        2.3.2 LpNAC6和LpNAC20基因的克隆与序列分析
        2.3.3 LpNAC6和LpNAC20基因的生物信息学分析
        2.3.4 LpNAC6和LpNAC20基因在四种非生物胁迫下的表达模式分析
    2.4 本章小结
3 LpNAC6和LpNAC20基因植物表达载体的构建及对烟草的遗传转化
    3.1 实验材料
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 主要试剂及菌株
        3.1.3 主要仪器设备
        3.1.4 相关培养基及试剂的配制
    3.2 实验方法
        3.2.1 加酶切位点中间表达载体的构建
        3.2.2 植物表达载体的构建
        3.2.3 大肠杆菌转化及重组质粒的验证
        3.2.4 植物表达载体转化农杆菌
        3.2.5 基因枪法转化洋葱表皮细胞
        3.2.6 叶盘法转化烟草
        3.2.7 转基因烟草T1代的筛选
    3.3 结果与分析
        3.3.1 中间表达载体的构建
        3.3.2 植物表达载体构建
        3.3.3 农杆菌菌液PCR鉴定
        3.3.4 LpNAC6和LpNAC20基因亚细胞定位检测
        3.3.5 转基因烟草的再生形态观察
        3.3.6 转LpNAC6和LpNAC20基因烟草的分子水平检测
        3.3.7 转LpNAC6和LpNACp20基因T1代烟草的获得
    3.4 本章小结
4 转LpNAC6和LpNAC20基因烟草的抗盐性分析
    4.1 实验材料
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 主要试剂
        4.1.3 主要仪器设备
        4.1.4 相关培养基及试剂的配制
    4.2 实验方法
        4.2.1 转基因烟草株系种子在盐胁迫下的抗性分析
        4.2.2 转基因烟草在盐胁迫下的生理指标测定
        4.2.3 数据处理
    4.3 结果与分析
        4.3.1 盐胁迫对转基因烟草种子萌发率的影响
        4.3.2 转基因烟草株系的耐盐性分析
    4.4 本章小结
5 讨论
    5.1 LpNAC6和LpNAC20基因参与细叶百合非生物胁胁迫响应
    5.2 LpNAC6和LpN4C20基因过表达可提高转型基因烟草抗盐性
结论
参考文献
攻读学位期间发表的学术论文
致谢
附件

【参考文献】

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1 萧蓓蕾;刘丽霞;冯建英;;盐胁迫对转ZmPP2C2基因烟草和野生型烟草部分生理生化指标的影响[J];安徽农业科学;2010年04期

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1 关春景;细叶百合3个NAC转录因子的克隆及其对烟草的遗传转化[D];东北林业大学;2018年

2 夏宁;小麦抗条锈病相关NAC转录因子基因的克隆及特征分析[D];西北农林科技大学;2010年

本文编号：2894666