SlIDA在番茄中的表达分析以及对花粉发育的影响

发布时间：2020-11-22 10:04

　　 番茄(Solanum lycopersicum)是重要的经济作物。在我国栽培面积广泛,因其营养价值高、物美价廉而被人们所喜爱。但在其开花结果期常因外界不适宜的环境,如高温、低温、干旱等,而造成花粉授粉不良、落花落果,从而影响番茄的产量。影响花粉发育的因素有多种,如环境条件、激素、营养供给等。近年来随着分子生物学的不断发展,人们发现花粉发育是受多种基因调控的一个复杂过程。IDA(INFLORESCENCE DEFICIENT IN ABSCISSION)最早被认为是一种调控拟南芥花器官脱落的信号肽。课题组前期发现SlIDA在番茄中调控脱落并不明显,本研究发现SlIDA在雄蕊中的表达量很高,且对ProSlIDA::GUS转基因番茄进行GUS染色时发现,雄蕊及其花粉中有表达。并结合前期获得的SlIDA RNAi沉默植株,分析了SlIDA在番茄花粉发育中的功能,其结果如下:1.番茄SlIDA基因时空表达特征分析显示,SlIDA基因主要在番茄花器官的雄蕊中表达。2.构建ProSlIDA::GUS转基因番茄,组织器官染色结果显示,SlIDA主要在雄蕊的花粉中表达。3.筛选T5代SlIDA沉默转基因植株,发现RNAi株系结实率和结子率显著降低,即使极个别RNAi株系结果,也是畸形果,且种子极少。这说明SlIDA影响了植株的坐果率和结籽率,杂交结果显示,RNAi植株主要影响了花粉的授粉受精。4.SlIDA RNAi株系花粉粒畸形,雄蕊不开裂,花粉活力和花粉萌发率显著低于野生型,这说明SlIDA影响了花粉发育。5.NBT和DAB染色检测SlIDA RNAi沉默转基因植株花粉发育过程中发现雄蕊ROS的积累量较野生型显著降低。以上这些结果表明,在番茄中SlIDA通过参与花粉发育从而影响番茄的坐果率和结籽率,进而影响了番茄产量。
【学位单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S641.2
【部分图文】：

图 1 花器官脱落的网络模式图（引自 Bin Liu et al., 2013）Fig.1 Model for networks controlling floral organ abscission (Cited from Bin Liu et al., 2013)1.1.2 IDA 与侧根发育的研究侧根的产生与脱落过程一样，可以分为不同的阶段。首个发现侧根原基起始于中柱鞘细胞的学者将拟南芥侧根的发生过程分为八个阶段（Malamy and Benfey, 1997）：I，建成细胞垂周分裂阶段；II，两细胞层的侧根原基阶段；III，三细胞层的侧根原基阶段；IV，四细胞层的侧根原基阶段；V，内皮层侧根原基阶段；VI，皮层侧根原基阶段；VII，接近突破表皮的侧根原基阶段；VIII，侧根露出表皮伸长阶段。这是目前最普遍、最容易接受的一种划分方式（刘大同等, 2013）。侧根发生过程必须经过内皮层、皮层和表皮细胞（Malamy and Benfey, 1997）。侧根的出现就像器官脱落一样，需要溶解相邻细胞的中间层。细胞壁水解（CWR）候选基因的定量表达被用来分析 IDA 信号如何影响侧根发生过程中 CWR 基因的表达。对于 XTH 和 EXP 基因家族成员，比如 XTH23/XTR6 和 EXP17（Laskowski et al., 2006; Gonzalez-Carranza et al., 2007; 2012; Swarup et al., 2008）在侧根原基表达，在 hae hsl2 双突变体而不是 hae 或 hsl2 单突变体中发现转录水平显著下降（Kumpf et al., 2013）。然而，PG 家族的两个基因 PGLR 和 PGAZAT/ADPG2（Swarupet al.,

2 IDA-HAE/HSL2 信号调控侧根发生模式图（引自 Kumpf et al., 2013l of IDA-HAE/HSL2 signaling regulates LR emergence (Cited from Kump长素的相关研究累在侧根原基（LRPs）的中央细胞，之后积累在 LRP 的顶端，一个关键调节因子（Peret et al., 2009）。假设生长素从侧根原在皮层中会诱导生长素内流载体 LIKE AUX1-3（LAX3）的表素进一步导入到皮层和表皮细胞层。在这些组织里，由生OOT1（SLR1）/IAA14 的降解释放 AUXIN RESPONSE FACTO录因子，导致细胞壁水解（CWR）基因的表达，如 EXP17、 et al., 2006; Swarup et al., 2008）。过程中，IDA 的表达依赖于生长素。证据来源于对 IDAS）在皮层和表皮细胞通过外施 IAA 或 NAA（1 μM）被激活的 IAA 之后的 6-24 h IDA 的表达水平增加 100 倍以上。在 arf水平被降低；而在 arf7 突变体中正常 IDA 感应被完全消除 ARF7 的下游（Kumpf et al., 2013）。但是没有证据说明 IDA并且生长素对 IDA 表达水平的影响可能是间接的。HAE 和 H

IDA::GUS 表达载体的构建 利用软件分析 SlIDA 启动子序列中的限制性，pBGWFS7.0 双元表达载体有多个克隆位点，选择合适的限制性内切不能切割目的片段，并在引物 5'末端添加酶切位点。引物为A-pro-F1：5'-TTTAACCATCTGATATCCGATTCT-3'，A-pro-R2：5'-ATGAAAGGATTATATTTTCTTGAATTTT-3'。以稀释 100 倍的质粒为模板进行 PCR，按照纯化试剂盒说明书将 PCR对纯化后的 TA 克隆重组质粒 SlIDA-pro-T 及载体 pBGWFS7.0 质粒 P酶切反应体系如下：表 5 酶切反应体系Table 5 Enzymereaction system组成成分Components体积VolumeSlIDA-pro-T 1 μLBamH 1 μLNco 1 1 μL10×Reaction Buffer 2 μLRNase-free 15 μLTotal 20 μL
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本文编号：2894530