应用酵母单杂交技术筛选柿DkPDC2互作转录因子的研究
发布时间：2020-12-05 22:30
完全甜柿自然脱涩存在两种机理,分别为“稀释效应”和“凝固效应”。日本原产完全甜柿（日本甜柿）以“稀释效应”为主,而中国原产完全甜柿（中国甜柿）既有“稀释效应”又有“凝固效应”,而“凝固效应”可能在中国甜柿自然脱涩中具有更重要的作用。已有研究表明,DkPDC2是乙醛代谢途径中的关键基因,而乙醛与可溶性单宁结合形成不溶性单宁,但其调控机制尚不完全清楚。本试验以中国甜柿‘罗田甜柿’为研究试材,通过酵母单杂交cDNA文库筛选和互作分析,以期获得调控DkPDC2的转录因子与其影响中国甜柿自然脱涩的分子机制。主要研究结果如下。1.通过酵母文库筛选获得候选转录因子,将其命名为DkMYB9。通过酵母单杂试验和双荧光素酶试验,验证候选转录因子DkMYB9可以激活DkPDC2启动子活性,表明DkMYB9与DkPDC2存在相互作用。2.聚类分析发现候选转录因子DkMYB9与拟南芥MYB家族中具有抑制花青素合成功能的AtMYB3和AtMYB4等聚为一类;氨基酸序列比对分析,结果显示候选转录因子DkMYB9具有R2R3结构域和MYB-bHLH相互结合基序。不同脱涩类型柿品种中DkMYB9和DkPDC2表达模式分...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
不同脱涩类型柿品种分类（根据Akagietal.2011，有修改）
图 2 乙醛代谢途径（Yamada and Sato 2002）Fig. 2 Acetaldehyde metabolic pathways (Yamada and Sato 2002)o 等（2016）从中国甜柿分离出 ADH 和 PDC 基因家族成员。通过柿，发现 DkPDC2 参与调控中国甜柿自然脱涩，且比 DkADH1 更能促进自然凝固。李慧（2016）通过染色体步移技术，获得不同柿脱涩类型中PDC 启动子序列，并对 DkPDC 启动子序列比较分析，发现在中国甜柿和‘罗田甜柿’品种中，DkPDC2 启动子序列高度一致，但是与日本甜柿相比较，启动子序列存在明显差异，即起始位点-372 bp– -363 b国甜柿品种中碱基序列为 TTTTG-ATT，日本甜柿‘阳丰’为 TTTTT盘柿’这一位点的序列缺失，推测可能由于不同脱涩类型柿品种在这序列导致其脱涩机理的不同。并以中国甜柿‘罗田甜柿’为材料，构均一化 cDNA 酵母文库。为后续筛选 DkPDC2 互作蛋白奠定了的材料等（2016）发现，丙酮酸激酶（Pyruvate Kinase, PK）基因可通过与互作进一步参与中国甜柿自然脱涩过程，并从酵母 cDNA 文库中筛选到1 互作的转录因子。
6图 3 酵母双杂交技术的原理（Fields and Song 1989）. 3 The Yeast two-hybrid principle (Fields and Song 1989)术现在被广泛应用。最早是由 Wang 和 Reed（1993）及其前体细胞中获得 OLF-1 转录因子的 cDNA。随子在植物上的调控。尤其在植物代谢和调控机理方面）以葡萄中 VviF3’H 基因的启动子为诱饵，通过酵录因子，并通过烟草瞬时转化和 EMSA 实验，最终动子区域。Li等（2017）通过酵母单杂交实验，说明CB9B2 响应非生物胁迫的必要条件。Gou 等（2017）通B107 可以直接作用于 FAR1、GPAT5、HHT 和 FAC
【参考文献】：
期刊论文
[1]原花青素的生物合成途径、功能基因和代谢工程[J]. 赵文军,张迪,马丽娟,柴友荣. 植物生理学通讯. 2009(05)
[2]酵母单杂交系统在植物基因工程研究中的应用[J]. 王琪,朱延明,王冬冬. 北京林业大学学报. 2008(01)
[3]烟草DREBP转录因子结合DRE元件的关键氨基酸[J]. 刘卫群,王永亮,郭红祥,赵同金,周海梦,郭蔼光. 中国生物化学与分子生物学报. 2006(02)
[4]酵母双杂交技术研究进展[J]. 张迪,霍克克,顾科隆,赵翔,李育阳. 高技术通讯. 2000(03)
[5]甘、涩柿果实主要化学成份的研究[J]. 费学谦,王劲风,周立红,龚榜初,吴开云. 林业科学研究. 1994(01)
博士论文
[1]中国甜柿cDNA-SSAP文库构建及自然脱涩相关基因功能验证[D]. 关长飞.华中农业大学 2016
[2]中国原产完全甜柿自然脱涩机理研究[D]. 王燕.华中农业大学 2010
硕士论文
[1]罗田甜柿（Diospyros kaki Thunb.）酵母杂交cDNA文库构建及DkPDC2启动子文库筛选[D]. 李慧.华中农业大学 2016
[2]与柿单宁自然凝固相关的ALDH2基因家族克隆与表达分析[D]. 丁金鸽.华中农业大学 2015
[3]中国原产完全甜柿‘鄂柿1号’自然脱涩特点研究[D]. 陈道明.华中农业大学 2008
本文编号：2900197
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
不同脱涩类型柿品种分类（根据Akagietal.2011，有修改）
图 2 乙醛代谢途径（Yamada and Sato 2002）Fig. 2 Acetaldehyde metabolic pathways (Yamada and Sato 2002)o 等（2016）从中国甜柿分离出 ADH 和 PDC 基因家族成员。通过柿，发现 DkPDC2 参与调控中国甜柿自然脱涩，且比 DkADH1 更能促进自然凝固。李慧（2016）通过染色体步移技术，获得不同柿脱涩类型中PDC 启动子序列，并对 DkPDC 启动子序列比较分析，发现在中国甜柿和‘罗田甜柿’品种中，DkPDC2 启动子序列高度一致，但是与日本甜柿相比较，启动子序列存在明显差异，即起始位点-372 bp– -363 b国甜柿品种中碱基序列为 TTTTG-ATT，日本甜柿‘阳丰’为 TTTTT盘柿’这一位点的序列缺失，推测可能由于不同脱涩类型柿品种在这序列导致其脱涩机理的不同。并以中国甜柿‘罗田甜柿’为材料，构均一化 cDNA 酵母文库。为后续筛选 DkPDC2 互作蛋白奠定了的材料等（2016）发现，丙酮酸激酶（Pyruvate Kinase, PK）基因可通过与互作进一步参与中国甜柿自然脱涩过程，并从酵母 cDNA 文库中筛选到1 互作的转录因子。
6图 3 酵母双杂交技术的原理（Fields and Song 1989）. 3 The Yeast two-hybrid principle (Fields and Song 1989)术现在被广泛应用。最早是由 Wang 和 Reed（1993）及其前体细胞中获得 OLF-1 转录因子的 cDNA。随子在植物上的调控。尤其在植物代谢和调控机理方面）以葡萄中 VviF3’H 基因的启动子为诱饵，通过酵录因子，并通过烟草瞬时转化和 EMSA 实验，最终动子区域。Li等（2017）通过酵母单杂交实验，说明CB9B2 响应非生物胁迫的必要条件。Gou 等（2017）通B107 可以直接作用于 FAR1、GPAT5、HHT 和 FAC
【参考文献】：
期刊论文
[1]原花青素的生物合成途径、功能基因和代谢工程[J]. 赵文军,张迪,马丽娟,柴友荣. 植物生理学通讯. 2009(05)
[2]酵母单杂交系统在植物基因工程研究中的应用[J]. 王琪,朱延明,王冬冬. 北京林业大学学报. 2008(01)
[3]烟草DREBP转录因子结合DRE元件的关键氨基酸[J]. 刘卫群,王永亮,郭红祥,赵同金,周海梦,郭蔼光. 中国生物化学与分子生物学报. 2006(02)
[4]酵母双杂交技术研究进展[J]. 张迪,霍克克,顾科隆,赵翔,李育阳. 高技术通讯. 2000(03)
[5]甘、涩柿果实主要化学成份的研究[J]. 费学谦,王劲风,周立红,龚榜初,吴开云. 林业科学研究. 1994(01)
博士论文
[1]中国甜柿cDNA-SSAP文库构建及自然脱涩相关基因功能验证[D]. 关长飞.华中农业大学 2016
[2]中国原产完全甜柿自然脱涩机理研究[D]. 王燕.华中农业大学 2010
硕士论文
[1]罗田甜柿（Diospyros kaki Thunb.）酵母杂交cDNA文库构建及DkPDC2启动子文库筛选[D]. 李慧.华中农业大学 2016
[2]与柿单宁自然凝固相关的ALDH2基因家族克隆与表达分析[D]. 丁金鸽.华中农业大学 2015
[3]中国原产完全甜柿‘鄂柿1号’自然脱涩特点研究[D]. 陈道明.华中农业大学 2008
本文编号：2900197
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