在香蕉镰刀菌侵染下香蕉钙依赖蛋白激酶基因（MaCDPK4）的功能分析

发布时间：2021-04-28 16:28

　　香蕉是热带亚热带重要的经济作物,在香蕉的生长过程中,许多因素限制了其生长,甚至导致大量减产,例如香蕉叶斑病和香蕉枯萎病。因此,研究生物胁迫对香蕉影响的分子机理对香蕉抵抗生物胁迫有非常重要的理论意义,为今后抗病育种提供了良好的基础。钙依赖蛋白激酶基因（CDPK）在抵抗病原菌侵染的过程中起到了重要的作用。本研究根据本实验室积累的工作,在已获得的MaCDPK4基因全长的基础之上,通过构建植物过表达载体转入烟草探究其功能;构建酵母双杂交诱饵载体,筛选与其互作的蛋白,取得结果如下:（1）构建了酵母双杂交诱饵载体pGBKT-7-MaCDPK4,转入酵母菌AH109进行自激活与毒性检测,在SD/-Trp/X-α-Gal,SD/-Ade/-His/-Trp/X-α-Gal固体培养基中并未发现蓝色菌斑,表明其无法自激活,在SD/-Trp固体培养基中,带空载体与带重组质粒的菌落生长情况一致,表明无毒性,适合进行酵母双杂交下一步实验。（2）构建了香蕉受香蕉枯萎病菌生理小种4号（FOC4）侵染后根的cDNA文库,将其与诱饵载体,文库载体共转入酵母菌AH109中进行酵母双杂交,将可能的阳性克隆测序,得到的片段进... 

【文章来源】：海南大学海南省 211工程院校

【文章页数】：50 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 香蕉的概念及所受灾害
        1.1.1 香蕉简介
        1.1.2 香蕉植株丰富的生物多样性
        1.1.3 香蕉枯萎病灾害
    1.2 钙依赖蛋白激酶概念概述
        1.2.1 钙依赖蛋白激酶概念
        1.2.2 CDPK结构与调控
        1.2.3 CDPK的表达与定位
        1.2.4 底物特异性
    1.3 CDPKs功能的研究进展
        1.3.1 CDPKs在免疫信号途径中被微生物病原体激活
        1.3.2 CDPKs在过氧化与细胞死亡中的作用
        1.3.3 对食草动物攻击与受伤的响应
        1.3.4 CDPKs调控ABA基因的表达和参与干旱和盐胁迫信号途径
        1.3.5 CDPKs在干旱与盐胁迫信号途径中的代谢和转运调控
        1.3.6 调控气孔的活动
        1.3.7 低温耐性
    1.4 本研究的目的和意义
    1.5 技术路线
2 材料与方法
    2.1 材料与试剂
        2.1.1 材料
        2.1.2 试剂
        2.1.3 所需引物
        2.1.4 所用仪器
    2.2 步骤与方法
        2.2.1 MaCDPK4酵母双杂交诱饵载体的构建和自激活及毒性检测
            2.2.1.1 PCR扩增MaCDPK4
            2.2.1.2 PCR产物纯化回收和酶切连接
            2.2.1.3 质粒转化大肠杆菌和扩增
            2.2.1.4 重组质粒pGBKT-7-MaCDPK4的鉴定
            2.2.1.5 酵母感受态细胞的制备
            2.2.1.6 重组质粒pGBKT-7-MaCDPK4的自激活及毒性检测
        2.2.2 香蕉在FOC4侵染后根的cDNA文库的构建
            2.2.2.1 香蕉在FOC4侵染后根的总RNA的提取
            2.2.2.2 cDNA第一链的合成
            2.2.2.3 双链cDNA的合成
            2.2.2.4 纯化柱纯化双链cDNA
        2.2.3 酵母双杂交及阳性克隆的筛选与验证
            2.2.3.1 酵母感受态的制备
            2.2.3.2 酵母共转化筛选pGBKT-7-MaCDPK4相互作用分子
            2.2.3.3 提取酵母菌质粒及PCR鉴定与测序
            2.2.3.4 互作蛋白基因的载体构建
            2.2.3.5 酵母双杂交验证互作
        2.2.4 香蕉CDPK4基因过表达载体的构建及遗传转化
            2.2.4.1 构建重组质粒PVKH-MaCDPK4
            2.2.4.2 农杆菌感受态的制备
            2.2.4.3 转化农杆菌
            2.2.4.4 农杆菌介导的遗传转化
        2.2.5 转基因烟草的筛选及鉴定
            2.2.5.1 烟草叶片基因组DNA的提取
            2.2.5.2 转基因T1代植株PCR扩增检测
            2.2.5.3 潮霉素筛选培养基筛选T1代种子
            2.2.5.4 转基因烟草T2代的分子鉴定
        2.2.6 FOC4处理对转基因烟草生长的影响和烟草基因的表达分析
            2.2.6.1 FOC4处理烟草幼苗
            2.2.6.2 烟草幼苗根的荧光检测
            2.2.6.3 FOC4处理下烟草基因的表达分析
3 结果与分析
    3.1 诱饵载体pGBKT-7-MaCDPK4的构建及其自激活及毒性检测
        3.1.1 诱饵载体pGBKT-7-MaCDPK4的酶切及PCR检测
        3.1.2 自激活及毒性检测
    3.2 FOC4处理的香蕉根系cDNA文库的构建及纯化与检测
        3.2.1 提取FOC4处理下香蕉根的总RNA
        3.2.2 香蕉根cDNA文库的构建及纯化与检测
    3.3 酵母双杂交
    3.4 阳性克隆的筛选及验证
        3.4.1 阳性克隆的筛选
        3.4.2 互作蛋白基因载体的构建
        3.4.3 酵母双杂交互作验证
    3.5 MaCDPK4植物表达载体的构建及检测
    3.6 植物表达载体转入农杆菌
    3.7 转基因烟草
        3.7.1 T1抗性苗筛选
        3.7.2 转基因烟草的PCR检测
        3.7.3 转基因烟草的RT-PCR检测
        3.7.4 T2代转基因烟草潮霉素筛选
        3.7.5 T3代转基因烟草纯合株系的获得
    3.8 FOC4处理下转基因烟草的表型及相关抗病基因的表达分析
        3.8.1 FOC4处理下转基因烟草的表型
        3.8.2 FOC4处理下烟草根的显微镜下观察
        3.8.3 FOC4处理下相关抗病基因的表达分析
4 讨论
    4.1 MaCDPK4转基因烟草对香蕉枯萎病菌抵抗能力增强
    4.2 酵母双杂交获得与MaCDPK4互作的蛋白
5 结论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]TaCDPK2基因在小麦与叶锈菌互作过程中的表达分析[J]. 程子义,魏凤菊,闫爱华,张蕴玮,王冬梅.  华北农学报. 2012(02)
[2]胞内钙库对小麦叶锈菌侵染之过敏反应的影响[J]. 张蓓,阎爱华,刘刚,刘猛,侯春燕,王冬梅.  作物学报. 2010(05)
[3]钙与叶锈菌侵染诱导小麦防卫反应的关系[J]. 侯春燕,王智炘,王冬梅.  华北农学报. 2007(01)
[4]影响Ca2+代谢和钙通道的药物对小麦受叶锈菌侵染后诱发的HR的作用[J]. 关春蕾,侯春燕,王冬梅.  河北农业大学学报. 2006(06)
[5]腺苷甲硫氨酸[J]. 景沛.  生命的化学(中国生物化学会通讯). 1995(02)



本文编号：3165799