4-香豆酰辅酶A连接酶（4CL）-芪合酶（STS）基因融合、表达、催化活性鉴定及其在枣树中的过表达

发布时间：2021-05-06 21:08

　　枣树是起源于我国的古老果树,目前是我国产量最高的干果类果树。近年来,我国枣树感病寄主呈现不断增加趋势,病原涉及9个真菌属和4个细菌属。枣树真菌病害已严重影响到枣果实的产量和品质。白藜芦醇是植物受到病原性进攻和环境恶化时产生的一种植保素,对植物真菌性病害具有明显的拮抗作用。对人类而言,白藜芦醇具有抗肿痈、保护心血管、抗氧化等多种功能。利用植物基因工程的基木原理和技术,将白藜芦醇生物合成途径关键基因转入枣树,不仅有望提高枣树拈抗真菌病害能力,也有可能改良枣果实的保健品质。白藜芦醇代谢途径中限速步骤较多,单纯过量表达某一个关键酶虽然可能对白藜芦醇的含量产生一定的促进作用,但由于其它步骤的限制,白藜芦醇高水平积累非常困难。要想大幅度提高转基因植物中白藜芦醇的含量,有必要进行多个基因共转化的尝试。通过基因融合技术产生的融合蛋白因存在“邻近效应”而具有更高的催化活性,是多基因共转化的首选,将构建的融合基因遗传转化枣树,有望大幅度提高白藜芦醇在枣树中的积累。白藜芦醇是芪合酶（STS）的产物,不同植物中STS的催化效率差异很大。白藜芦醇生物合成途径中,为STS提供4-香豆酰辅酶A底物的4-香豆酰辅酶A... 

【文章来源】：北京林业大学北京市 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：113 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词
第一章 前言
    1.1 白藜芦醇研究概述
        1.1.1 白藜芦醇的结构和理化性质
        1.1.2 白藜芦醇的发现
        1.1.3 白藜芦醇的生物活性及应用
        1.1.4 白藜芦醇的生物合成途径
        1.1.5 芪合酶的结构和功能
        1.1.6 芪合酶基因的转基因植物表达
    1.2 枣树研究概述
        1.2.1 枣树的组织培养和遗传转化
        1.2.2 枣果实主要病害
    1.3 基因融合研究概述
        1.3.1 基因融合的概念及特点
        1.3.2 融合蛋白发挥功能的关键——Linker
        1.3.3 基因融合的常用技术
        1.3.4 Linker序列的设计
        1.3.5 基因融合的应用
    1.4 本研究的目的意义
    1.5 本研究主要内容
第二章 葡萄和虎杖芪合酶催化效率比较与分析
    2.1 材料与方法
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株、载体和试剂
        2.1.3 主要仪器
        2.1.4 葡萄基因组DNA的提取
        2.1.5 VvSTS基因的分离
        2.1.6 PCR产物的回收
        2.1.7 目的片段与克隆载体的连接
        2.1.8 大肠杆菌感受态的制备、转化、及筛选
        2.1.9 大肠杆菌质粒的提取
        2.1.10 目的片段与表达载体的连接
        2.1.11 重组质粒的双酶切
        2.1.12 蛋白表达与纯化
        2.1.13 蛋白脱盐与浓缩
        2.1.14 酶催化活性及动力学分析
    2.2 结果与分析
        2.2.1 葡萄芪合酶基因VvSTS的克隆
        2.2.2 基因序列分析
        2.2.3 原核表达载体的构建
        2.2.4 芪合酶基因在大肠杆菌中的表达
        2.2.5 芪合酶功能鉴定及酶学性质分析
    2.3 讨论
第三章 4CL-STS基因融合、表达、催化活性鉴定与分析
    3.1 材料与方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 模板与引物
        3.1.3 融合基因的克隆与原核表达载体的构建
        3.1.4 融合基因的表达与纯化
        3.1.5 体外酶促反应与产物检测
        3.1.6 酶动力学分析
        3.1.7 融合蛋白同源模型的构建
    3.2 结果与分析
        3.2.1 不同Linker融合基因的克隆
        3.2.2 融合基因原核表达载体的构建
        3.2.3 融合基因在大肠杆菌中的表达与纯化
        3.2.4 融合酶功能鉴定与酶学性质分析
        3.2.5 融合酶同源模型分析
    3.3 讨论
第四章 4CL-STS融合基因在枣树中的过表达
    4.1 材料与方法
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 菌株、载体与试剂
        4.1.3 模板与引物
        4.1.4 农杆菌感受态细胞的制备及转化
        4.1.5 农杆菌介导的转化壶瓶枣
        4.1.6 转基因壶瓶枣的PCR检测
        4.1.7 转基因壶瓶枣的PCR-Southern blot检测
        4.1.8 转基因壶瓶枣的Northern blot检测
        4.1.9 转基因植株中白藜芦醇含量的测定
        4.1.10 转基因植株抑菌活性检测
    4.2 结果与分析
        4.2.1 连植物表达载体的融合基因克隆
        4.2.2 植物表达载体的构建和根癌农杆菌的转化
        4.2.3 壶瓶枣遗传转化体系条件筛选
        4.2.4 转基因植株的获得
        4.2.5 转基因植株的检测
        4.2.6 转基因壶瓶枣白藜芦醇含量的测定
        4.2.7 转基因植株提取液的抑菌活性
    4.3 讨论
第五章 结论与展望
    5.1 主要结论
    5.2 创新点
    5.3 展望
参考文献
个人简介
导师简介
获得成果目录
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]木聚糖酶-甘露聚糖酶融合酶基因Linker优化及其在猪肾pK15细胞中共表达[J]. 张献伟,张冠冠,吴珍芳,孟繁明,刘德武,张茂,许卫华,郑恩琴,贺晓燕,李真,李紫聪.  中国农业科学. 2013(22)
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博士论文
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硕士论文
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[2]枣（Ziziphus jujuba Mill.）离体叶片高效再生体系的建立[D]. 周瑞金.河北农业大学 2004
[3]葡萄白藜芦醇合酶的生化信息研究[D]. 党尉.西北大学 2003
[4]枣树叶片再生植株的研究[D]. 何振艳.山西农业大学 2001



本文编号：3172618