基于菊花转录组测序的DgWRKY2基因的克隆和转基因植株的耐盐性评价

发布时间：2021-05-13 17:58

　　菊花（Chrysanthemum grandiflorum Ramat.）是世界四大鲜切花之一,观赏和经济价值极高,但切花菊周年生产过程中,普遍存在土壤盐渍化问题,严重影响切花产量与品质。WRKY转录因子在响应各种非生物胁迫中发挥重要作用。本研究以盐胁迫下’神马’菊花叶片为实验材料,采用IlluminaHiSeqTM2000双末端测序技术对菊花进行转录组数据信息分析,克隆得到1个WRKY基因并遗传转化’神马’菊花,为通过分子生物学手段提高栽培菊花的耐盐性提供理论依据。主要研究结果如下:1.利用盐胁迫下菊花叶片为材料建立cDNA文库,采用Illumina HiSeqTM 2000系统进行转录组测序,共获得有效序列0.94亿条,平均长度94.37 bp。序列经组装得到365323个长度大于100 bp的转录本,进一步拼接后,共获得161522条Unigenes。161522条Unigenes全部被比对到公共数据库中,其中比对到GO和KOG数据库的Unigenes分别为12153和23477条,共有25173条Unigenes被KEGG注释参与到306个pathway中,然后根据差异表达基因... 

【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校

【文章页数】：72 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
1 文献综述
    1.1 植物耐盐基因的研究概况和发展趋势
        1.1.1 渗透调节相关基因
        1.1.2 抗氧化胁迫相关基因
        1.1.3 信号转导相关基因
        1.1.4 编码抗胁迫转录因子的基因
    1.2 WRKY转录因子的研究
        1.2.1 WRKY转录因子概述
        1.2.2 WRKY转录因子在植物非生物胁迫中的作用
    1.3 转录组测序技术的研究
        1.3.1 转录组测序技术概述
        1.3.2 新一代转录组测序技术的应用
        1.3.3 转录组测序技术在植物盐胁迫响应基因筛选中的应用
    1.4 研究内容及日的意义
    1.5 技术路线
2 菊花转录组测序
    2.1 实验材料
        2.1.1 植物材料与预处理
        2.1.2 实验设备仪器
        2.1.3 实验试剂
    2.2 实验方法
        2.2.1 菊花总RNA的提取与检测
        2.2.2 cDNA文库的制备与上机测序
        2.2.3 序列组装
        2.2.4 基因功能注释
        2.2.5 差异基因分析
        2.2.6 Quantitative Real-time PCR (qPCR)验证
    2.3 结果与分析
        2.3.1 转录组序列组装及分析
        2.3.2 转录本的功能注释
        2.3.3 与菊花盐胁迫响应有关的差异表达基因
        2.3.4 qPCR验证结果分析
3 WRKY2基因的克隆和对菊花的遗传转化
    3.1 实验材料
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 实验仪器
        3.1.3 实验主要试剂和菌株
        3.1.4 引物序列
    3.2 实验方法
        3.2.1 菊花总RNA的提取与检测
        3.2.2 cDNA的合成和gDNA去除
        3.2.3 引物设计与PCR扩增
        3.2.4 PCR产物的检测与胶回收
        3.2.5 PCR回收产物的连接转化
        3.2.6 基因序列分析
        3.2.7 菊花DgWRKY2基因表达载体的构建
        3.2.8 农杆菌感受态的制备
        3.2.9 重组质粒转化农杆菌感受态细胞
        3.2.10 农杆菌介导法转化菊花
        3.2.11 转基因阳性植株的鉴定
        3.2.12 转基因植株的表达
    3.3 结果与分析
        3.3.1 DgWRKY2全长的获得
        3.3.2 DgWRKY2基因的序列分析
        3.3.3 DgWRKY2蛋白的生物信息学分析
        3.3.4 DgWRKY2蛋白的同源性分析及系统进化发育树分析
        3.3.5 转基因植株的获得及表达水平
        3.3.6 DgWRKY2过表达菊花植株的表型观察
4 DgWRKY2基因的耐盐性评价
    4.1 实验材料
        4.1.1 植物材料
        4.1.2 实验设备仪器
        4.1.3 实验试剂
    4.2 实验方法
        4.2.1 盐胁迫处理
        4.2.2 盐胁迫下转基因菊花的生理指标测定
        4.2.3 氮蓝四唑(NBT)和二氨基联苯胺(DAB)染色
        4.2.4 DgWRKY2相关耐盐调控基因在盐胁迫处理下的表达分析
        4.2.5 数据处理与分析
    4.3 结果与分析
        4.3.1 盐胁迫下菊花幼苗生理生化特性的变化
        4.3.2 DgWRKY2相关耐盐调控基因在盐胁迫处理下的表达分析
5 讨论
    5.1 盐胁迫下菊花转录组信息分析
        5.1.1 盐胁迫下菊花差异表达基因的筛选与分析
        5.1.2 调节菊花耐盐性的转录因子
    5.2 DgWRKY2的获得与生物信息学分析
    5.3 转DgWRKY2基因菊花耐盐机理探讨
    5.4 DgWRKY2基因在盐胁迫应答过程中参与的信号转导通路
6 结论
参考文献
致谢
攻读硕士学位期间发表的学术论文


【参考文献】：
期刊论文
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博士论文
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硕士论文
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[2]小麦盐诱导表达TaWRKY79、TaWRKY80转录因子基因的克隆及功能分析[D]. 田延臣.山东农业大学 2012
[3]SOS1 RNAi对盐芥耐盐性的影响[D]. 马文英.山东师范大学 2006



本文编号：3184465