CRISPR/Cas9技术在高羊茅FaSGR基因敲除中的应用
发布时间：2021-05-17 19:06
高羊茅（Festuca arundinacea Schreb）是多年生禾本科羊茅属（Festuca）草本植物,因其抗逆性强、耐践踏、耐粗放管理,被广泛应用于水土保持及绿化工程;冷季型草在夏季有“休眠”现象,这限制了高羊茅在夏季的使用,所以延长高羊茅绿期是重要的育种目标之一。CRISPR/Cas9系统作为一种新兴的基因编辑技术,因其系统构建简单、精准度髙、能同时对多个位点进行定点编辑、成本低等优点成为目前研究的热点。本研究利用Ca（Cl O）2代替升汞消毒剂,优化高羊茅种子消毒方式;再运用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建高羊茅Fa SGR基因敲除载体;最后利用农杆菌介导法将该表达载体转入高羊茅愈伤组织内进行遗传表达,并通过测序和实时荧光PCR技术检验转基因植株中SGR基因的突变和表达情况,为CRISPR/Cas9基因编辑技术在高羊茅遗传改良上的运用奠定研究基础,主要结论如下:1)利用Ca（Cl O）2作为消毒剂处理高羊茅种子（升汞消毒剂为对照组）,以三种不同的前处理方式与不同浓度Ca（Cl O）2溶液和不同消毒时间相配合,分别对高羊茅种子进行消毒。结果表明前处理方式仅用Ca（Cl ...
【文章来源】：湖南农业大学湖南省
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第1章 绪论
1.1 SGR基因的研究进展
1.1.1 SGR基因
1.1.2 叶绿素降解及SGR基因的功能
1.2 CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在植物中的应用
1.2.1 CRISPR/Cas基因编辑系统
1.2.2 CRISPR/Cas9基因编辑系统
1.2.3 CRISPR/Cas9基因编辑系统在植物中的应用
1.3 高羊茅及其基因工程研究进展
1.3.1 高羊茅
1.3.2 高羊茅基因工程的研究进展
1.4 论文研究目的和意义
第2章 高羊茅再生体系的建立和消毒方式的优化
2.1 材料与仪器
2.1.1 材料
2.1.2 再生体系建立
2.1.3 实验仪器
2.2 方法
2.2.1 愈伤组织的诱导
2.2.2 愈伤诱导培养条件
2.2.3 再生体系的优化
2.2.4 最优消毒处理方式下不同品种高羊茅验证
2.2.5 测定指标
2.2.6 数据统计处理方法
2.3 结果与分析
2.3.1 不同前处理方式对种子消毒效果的影响
2.3.2 不同高羊茅品种种子的发芽实验
2.3.3 最优消毒处理下不同高羊茅品种种子的表现
2.4 讨论
第3章 CRISPR/Cas9技术敲除高羊茅FaSGR基因载体构建
3.1 材料与试剂
3.1.1 实验材料
3.1.2 实验试剂
3.1.3 实验仪器
3.2 方法
3.2.1 FaSGR基因CDS区相关外显子序列的确定
3.2.2 PCR产物测序
3.2.3 FaSGR基因的sgRNA靶点的设计和选择
3.2.4 FaSGR最终载体的构建
3.3 结果与分析
3.3.1 目的片段的克隆与验证
3.3.2 预计条带的测序
3.3.3 FaSGR-gRNA靶点酶切验证
3.3.4 靶点体外切割活性检测
3.3.5 FaSGR质粒的构建
3.3.6 表达载体的鉴定和检测
3.4 讨论
第4章 农杆菌介导遗传转化体系的建立
4.1 材料和仪器
4.1.1 材料
4.1.2 实验试剂
4.1.3 实验仪器
4.2 方法
4.2.1 农杆菌细胞活化
4.2.2 冻融法转化的农杆菌感受态细胞的制备
4.2.3 将FaSGR-Cas9表达载体转入农杆菌
4.2.4 农杆菌介导遗传转化
4.2.5 阳性植株的鉴定
4.2.6 转基因株系基因表达量检测
4.3 结果与分析
4.3.1 FaSGR-Cas9表达载体转化农杆菌及其验证
4.3.2 卡那霉素浓度对农杆菌生长的影响
4.3.3 高羊茅愈伤组织对潮霉素的抗性
4.3.4 抗性愈伤的筛选、分化和生根
4.3.5 转基因植株的鉴定和检测
4.3.6 野生型株系和转基因株系中FaSGR基因表达量的检测
4.4 讨论
第5章 总结
5.1 本研究主要结论
5.2 本研究特色与创新之处
5.3 后续研究工作展望
参考文献
附录
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]高羊茅应答盐胁迫的AtSOS途径基因的效应分析[J]. 麻冬梅,秦楚,倪星,许兴,郭伶娜. 草业学报. 2016(12)
[2]植物叶绿素降解机制研究进展[J]. 丁跃,吴刚,郭长奎. 生物技术通报. 2016(11)
[3]CRISPR/Cas9基因组定向编辑技术的发展与在作物遗传育种中的应用[J]. 景润春,卢洪. 中国农业科学. 2016(07)
[4]转SOS基因高羊茅的耐盐性鉴定[J]. 倪星,秦楚,平玲,麻冬梅,许兴. 草原与草坪. 2016(01)
[5]CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术及其在作物品种改良中的应用[J]. 平文丽,李雪君,林娟,丁燕芳,孙焕,孙计平. 中国农学通报. 2016(05)
[6]高羊茅FaSRP基因克隆及在非生物胁迫下表达分析（英文）[J]. 于二汝,李小冬,舒健虹,吴佳海,王小利. Agricultural Science & Technology. 2015(10)
[7]CRISPR/Cas9基因组编辑技术在植物基因功能研究及植物改良中的应用[J]. 曾秀英,侯学文. 植物生理学报. 2015(09)
[8]植物滞绿基因STAY-GREEN的研究进展[J]. 孙佩光,吴琼,徐碧玉,常胜合,苗红霞,金志强. 植物生理学报. 2015(07)
[9]CRISPR/Cas9系统在植物基因组定点编辑中的研究进展[J]. 解莉楠,宋凤艳,张旸. 中国农业科学. 2015(09)
[10]植物滞绿机理研究进展[J]. 孙佩光,吴琼,徐碧玉,苗红霞,金志强. 基因组学与应用生物学. 2015(02)
硕士论文
[1]高羊茅Fa5GR基因克隆及其RNAi基因沉默体系的构建研究[D]. 文昭竹.湖南农业大学 2016
[2]雪里蕻滞绿基因SGR的克隆及转化研究[D]. 代法国.重庆大学 2011
本文编号：3192287
【文章来源】：湖南农业大学湖南省
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第1章 绪论
1.1 SGR基因的研究进展
1.1.1 SGR基因
1.1.2 叶绿素降解及SGR基因的功能
1.2 CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在植物中的应用
1.2.1 CRISPR/Cas基因编辑系统
1.2.2 CRISPR/Cas9基因编辑系统
1.2.3 CRISPR/Cas9基因编辑系统在植物中的应用
1.3 高羊茅及其基因工程研究进展
1.3.1 高羊茅
1.3.2 高羊茅基因工程的研究进展
1.4 论文研究目的和意义
第2章 高羊茅再生体系的建立和消毒方式的优化
2.1 材料与仪器
2.1.1 材料
2.1.2 再生体系建立
2.1.3 实验仪器
2.2 方法
2.2.1 愈伤组织的诱导
2.2.2 愈伤诱导培养条件
2.2.3 再生体系的优化
2.2.4 最优消毒处理方式下不同品种高羊茅验证
2.2.5 测定指标
2.2.6 数据统计处理方法
2.3 结果与分析
2.3.1 不同前处理方式对种子消毒效果的影响
2.3.2 不同高羊茅品种种子的发芽实验
2.3.3 最优消毒处理下不同高羊茅品种种子的表现
2.4 讨论
第3章 CRISPR/Cas9技术敲除高羊茅FaSGR基因载体构建
3.1 材料与试剂
3.1.1 实验材料
3.1.2 实验试剂
3.1.3 实验仪器
3.2 方法
3.2.1 FaSGR基因CDS区相关外显子序列的确定
3.2.2 PCR产物测序
3.2.3 FaSGR基因的sgRNA靶点的设计和选择
3.2.4 FaSGR最终载体的构建
3.3 结果与分析
3.3.1 目的片段的克隆与验证
3.3.2 预计条带的测序
3.3.3 FaSGR-gRNA靶点酶切验证
3.3.4 靶点体外切割活性检测
3.3.5 FaSGR质粒的构建
3.3.6 表达载体的鉴定和检测
3.4 讨论
第4章 农杆菌介导遗传转化体系的建立
4.1 材料和仪器
4.1.1 材料
4.1.2 实验试剂
4.1.3 实验仪器
4.2 方法
4.2.1 农杆菌细胞活化
4.2.2 冻融法转化的农杆菌感受态细胞的制备
4.2.3 将FaSGR-Cas9表达载体转入农杆菌
4.2.4 农杆菌介导遗传转化
4.2.5 阳性植株的鉴定
4.2.6 转基因株系基因表达量检测
4.3 结果与分析
4.3.1 FaSGR-Cas9表达载体转化农杆菌及其验证
4.3.2 卡那霉素浓度对农杆菌生长的影响
4.3.3 高羊茅愈伤组织对潮霉素的抗性
4.3.4 抗性愈伤的筛选、分化和生根
4.3.5 转基因植株的鉴定和检测
4.3.6 野生型株系和转基因株系中FaSGR基因表达量的检测
4.4 讨论
第5章 总结
5.1 本研究主要结论
5.2 本研究特色与创新之处
5.3 后续研究工作展望
参考文献
附录
致谢
作者简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]高羊茅应答盐胁迫的AtSOS途径基因的效应分析[J]. 麻冬梅,秦楚,倪星,许兴,郭伶娜. 草业学报. 2016(12)
[2]植物叶绿素降解机制研究进展[J]. 丁跃,吴刚,郭长奎. 生物技术通报. 2016(11)
[3]CRISPR/Cas9基因组定向编辑技术的发展与在作物遗传育种中的应用[J]. 景润春,卢洪. 中国农业科学. 2016(07)
[4]转SOS基因高羊茅的耐盐性鉴定[J]. 倪星,秦楚,平玲,麻冬梅,许兴. 草原与草坪. 2016(01)
[5]CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术及其在作物品种改良中的应用[J]. 平文丽,李雪君,林娟,丁燕芳,孙焕,孙计平. 中国农学通报. 2016(05)
[6]高羊茅FaSRP基因克隆及在非生物胁迫下表达分析（英文）[J]. 于二汝,李小冬,舒健虹,吴佳海,王小利. Agricultural Science & Technology. 2015(10)
[7]CRISPR/Cas9基因组编辑技术在植物基因功能研究及植物改良中的应用[J]. 曾秀英,侯学文. 植物生理学报. 2015(09)
[8]植物滞绿基因STAY-GREEN的研究进展[J]. 孙佩光,吴琼,徐碧玉,常胜合,苗红霞,金志强. 植物生理学报. 2015(07)
[9]CRISPR/Cas9系统在植物基因组定点编辑中的研究进展[J]. 解莉楠,宋凤艳,张旸. 中国农业科学. 2015(09)
[10]植物滞绿机理研究进展[J]. 孙佩光,吴琼,徐碧玉,苗红霞,金志强. 基因组学与应用生物学. 2015(02)
硕士论文
[1]高羊茅Fa5GR基因克隆及其RNAi基因沉默体系的构建研究[D]. 文昭竹.湖南农业大学 2016
[2]雪里蕻滞绿基因SGR的克隆及转化研究[D]. 代法国.重庆大学 2011
本文编号：3192287
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/yylw/3192287.html
