叶用芥菜紫色性状基因的克隆分析和遗传转化
发布时间：2021-05-24 07:53
芥菜（Brassica juncea Czern.et Coss.）,十字花科芸薹属作物,是我国重要的栽培蔬菜、油料作物和调料作物,具有很高的经济价值。紫叶芥作为叶用芥菜的一种,花青素含量显著高于一般叶用芥菜。本研究在张甜构建的六世代遗传群体的基础上,以紫色芥菜自交系品种（L17-P）和绿色芥菜自交系品种（L17-G）为主要研究材料,基于刘丽艳（2015）和张甜（2017）的研究结果,对位于B02染色体上的候选基因Bj.Pur（转录因子MYB90）进行克隆分析和遗传转化。研究结果如下:1、Bj.Pur基因编码的蛋白结构分析。将Bj.Pur基因编码的242个氨基酸序列信息提交至NCBI Conserved domains（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）进行蛋白结构域与功能分析,结果显示N端高度保守的MYB结构域位于8-105个氨基酸的位置,属于R2R3-MYB转录因子,且该蛋白与萝卜的转录因子MYB114-like相似性较高,为92%。2、花青素含量和叶绿素含量的比较分析。对紫色芥菜自交系品种（L17-P）和绿色芥菜自交系品种（L17-G）及杂交后代F...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：75 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
1 前言
1.1 花青素的研究进展
1.1.1 花青素总述
1.1.2 花青素的功能
1.1.3 外界因素对于花青素合成的影响
1.1.3.1 光照对于花青素合成的影响
1.1.3.2 温度对于花青素合成的影响
1.1.3.3 糖对花青素合成的影响
1.1.3.4 植物激素对花青素合成的影响
1.1.4.1 花青素的合成代谢途径
1.1.4.2 花青素合成代谢途径中的结构基因
1.2 MYB转录因子研究进展
1.2.1 MYB转录因子的结构
1.2.2 MYB转录因子的功能
1.2.2.1 MYB转录因子参与植物次生物质的代谢
1.2.2.2 MYB转录因子调控植物生长发育代谢
1.2.2.3 MYB转录因子参与植物激素应答
1.2.3 MYB转录因子调控颜色差异机制
1.3 十字花科芸薹属作物紫色形状基因定位的研究进展
1.4 十字花科芸薹属类植物遗传转化研究进展
1.5 本课题研究背景和意义
2 材料和方法
2.1 材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 菌种及载体
2.1.2.1 供试菌种
2.1.2.2 载体
2.1.3 主要生化试剂
2.1.4 相关试剂和培养基的配制
2.1.4.1 培养基的配制
2.1.4.2 相关试剂的配制
2.2 试验方法
2.2.1 植物材料的处理
2.2.1.1 胁迫材料的处理
2.2.1.2 胁迫材料的取样
2.2.2 相关色素含量的测定
2.2.3 分子标记的开发
2.2.3.1 总DNA的提取
2.2.3.2 SSR标记的筛选和基于SNP位点的引物设计
2.2.4 qRT-PCR表达量分析
2.2.4.1 Trizol法提取植物总RNA
2.2.3.2 反转录反应
2.2.3.3 qRT-PCR检测
2.2.5 表达载体的构建
2.2.5.1 PCR反应体系及产物的回收
2.2.5.2 质粒的提取
2.2.5.3 线性化载体的制备
2.2.5.4 同源重组法构建表达载体
2.2.5.5 重组产物转化
2.2.5.6 重组产物的鉴定
2.2.6 芥菜遗传转化
2.2.7 烟草瞬时表达
2.2.7.1 烟草侵染注射
2.2.7.2 烟草GUS染色
3 结果与分析
3.1 蛋白结构分析
3.2 亲本及杂交F_1 代的花青素与叶绿素含量的比较分析
3.3 与Bj.Pur基因连锁的标记的筛选
3.4 花青素合成相关基因的表达量分析
3.4.1 莲座期不同部位叶片Bj.Pur(BjMYB90)表达量分析
3.4.2 开花期植株不同部位Bj.Pur(BjMYB90)表达量分析
3.4.3 莲座期花青素合成相关基因表达量分析
3.4.4 环境胁迫下花青素合成相关基因在紫叶芥中的表达量分析
3.5 候选基因Bj.Pur(BjMYB90)的遗传转化与功能验证
3.5.1 p35s:P-MYB90 超表达载体的构建
3.5.2 拟南芥遗传转化
3.5.3 芥菜遗传转化
3.6 Bj.Pur(BjMYB90)基因启动子序列的克隆与分析
3.6.1 Bj.Pur(BjMYB90)基因启动子序列的克隆
3.6.2 启动子GUS报告基因载体的构建
3.7 不同芥菜种质资源中产生叶色差异机制的初步探究
3.7.1 插入片段差异的探究
3.7.2 启动子差异的探究
4 讨论
4.1 Bj.Pur基因的功能探究
4.2 芥菜叶色差异机制探究
4.3 后续工作计划
参考文献
附录1 :qPCR过程中所用引物
附录2 :41 份绿色芥菜材料和11 份紫色芥菜材料品种一览表
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]利用CRISPR/Cas9技术敲除拟南芥转录因子MYB40的两种可变剪接体[J]. 李孟湛,尹红菊,李丁丁,刘亚琪,王锁民. 草业学报. 2019(01)
[2]小兰屿蝴蝶兰R2R3-MYB转录因子分析[J]. 王雪霁,梁立雄,李潞滨,王涛. 林业科学研究. 2018(03)
[3]观赏羽衣甘蓝BoMYB114基因编码区的克隆及序列分析[J]. 王玉书,王欢,庞彩燕. 分子植物育种. 2018(14)
[4]芥菜类蔬菜杂种优势利用的研究进展与展望[J]. 万正杰,李海渤,姚培杰,刘旭佳,徐玉颖,傅廷栋,邹瑞昌,徐跃进. 华中农业大学学报. 2018(01)
[5]芥菜类蔬菜产业发展现状及研究前景思考（英文）[J]. 范永红,沈进娟,董代文. Agricultural Science & Technology. 2017(03)
[6]芸薹属物种（B.napus,B.rapa,B.oleracea,B.juncea,B.nigra）MYB28家族的分子进化[J]. 陆俊杏,白辉扬,张涛. 分子植物育种. 2017(02)
[7]植物转录因子MYB基因家族的研究进展[J]. 牛义岭,姜秀明,许向阳. 分子植物育种. 2016(08)
[8]MicroRNA828负调控缺磷胁迫诱导的番茄花青素生物合成[J]. 贾小云,刘慧,沈洁,李芳,丁娜,孙岩,高昌勇,李润植. 中国农业科学. 2015(15)
[9]小麦R2R3-MYB转录因子TaMYB3-4D的克隆及功能分析[J]. 王延谦,张波,陈文杰,刘登才,刘宝龙,张怀刚. 西北植物学报. 2015(04)
[10]R2R3MYB转录因子在果树花青素合成中的调控作用[J]. 李永杰,谢让金,邓烈. 中国南方果树. 2014(06)
博士论文
[1]甜橙CsMYBF1基因的功能鉴定和调控机理研究[D]. 刘朝阳.华中农业大学 2016
[2]番茄花青素缺失基因Hoffman’s Anthocyaninless的图位克隆及功能分析[D]. 邱正坤.中国农业科学院 2016
[3]甘蓝型油菜紫叶基因BnaA.PL1定位和候选基因分析[D]. 李海渤.华中农业大学 2016
[4]桃花青苷着色及原花青素合成的调控机制研究[D]. 周晖.中国科学院研究生院(武汉植物园) 2015
[5]大白菜紫红色基因定位和候选基因分析[D]. 张淑江.中国农业科学院 2014
[6]白菜花青苷和黄酮醇苷自然变异及遗传机制研究[D]. 郭宁.中国农业科学院 2014
[7]小麦MYB转录因子的功能研究[D]. 张立超.中国农业科学院 2013
[8]油菜种子高油酸低亚麻酸的遗传控制及等位基因特异标记开发[D]. 杨庆勇.华中农业大学 2012
[9]芥菜型油菜胞质不育Hau CMS不育相关基因的鉴定及其功能分析[D]. 景兵.华中农业大学 2012
[10]芸薹属植物花青素生物合成代谢途径调控机制的研究[D]. 张彬.重庆大学 2011
硕士论文
[1]草莓FvMYB6-like基因的克隆及功能分析[D]. 石伟佳.沈阳农业大学 2018
[2]苹果MdMYB2基因的克隆及功能鉴定[D]. 曲丰佳.山东农业大学 2018
[3]桑椹花青素合成相关miRNAs的鉴定及其功能研究[D]. 赵怀宁.山东农业大学 2018
[4]玉米ZmMYB59转录因子的亚细胞定位、启动子功能鉴定及在烟草中的表达分析[D]. 孙彩霞.浙江农林大学 2017
[5]芥菜紫叶基因Bj.Pur定位及候选基因分析[D]. 张甜.华中农业大学 2017
[6]番茄SlMYB102基因的克隆及耐盐功能的初步鉴定[D]. 陈丽琛.山东农业大学 2017
[7]辣椒素合成结构基因及MYB转录因子的克隆和功能验证[D]. 周欣.华南农业大学 2016
[8]红梨果皮着色相关R2R3型MYB转录因子基因功能分析[D]. 王智敏.西北农林科技大学 2016
[9]番茄miR858的克隆与干旱应答及其对花青素生物合成的负调控机制研究[D]. 沈洁.山西农业大学 2015
[10]大豆诱导型NAC转录因子基因启动子克隆及功能研究[D]. 杨丹.山东大学 2015
本文编号：3203845
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：75 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
1 前言
1.1 花青素的研究进展
1.1.1 花青素总述
1.1.2 花青素的功能
1.1.3 外界因素对于花青素合成的影响
1.1.3.1 光照对于花青素合成的影响
1.1.3.2 温度对于花青素合成的影响
1.1.3.3 糖对花青素合成的影响
1.1.3.4 植物激素对花青素合成的影响
1.1.4.1 花青素的合成代谢途径
1.1.4.2 花青素合成代谢途径中的结构基因
1.2 MYB转录因子研究进展
1.2.1 MYB转录因子的结构
1.2.2 MYB转录因子的功能
1.2.2.1 MYB转录因子参与植物次生物质的代谢
1.2.2.2 MYB转录因子调控植物生长发育代谢
1.2.2.3 MYB转录因子参与植物激素应答
1.2.3 MYB转录因子调控颜色差异机制
1.3 十字花科芸薹属作物紫色形状基因定位的研究进展
1.4 十字花科芸薹属类植物遗传转化研究进展
1.5 本课题研究背景和意义
2 材料和方法
2.1 材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 菌种及载体
2.1.2.1 供试菌种
2.1.2.2 载体
2.1.3 主要生化试剂
2.1.4 相关试剂和培养基的配制
2.1.4.1 培养基的配制
2.1.4.2 相关试剂的配制
2.2 试验方法
2.2.1 植物材料的处理
2.2.1.1 胁迫材料的处理
2.2.1.2 胁迫材料的取样
2.2.2 相关色素含量的测定
2.2.3 分子标记的开发
2.2.3.1 总DNA的提取
2.2.3.2 SSR标记的筛选和基于SNP位点的引物设计
2.2.4 qRT-PCR表达量分析
2.2.4.1 Trizol法提取植物总RNA
2.2.3.2 反转录反应
2.2.3.3 qRT-PCR检测
2.2.5 表达载体的构建
2.2.5.1 PCR反应体系及产物的回收
2.2.5.2 质粒的提取
2.2.5.3 线性化载体的制备
2.2.5.4 同源重组法构建表达载体
2.2.5.5 重组产物转化
2.2.5.6 重组产物的鉴定
2.2.6 芥菜遗传转化
2.2.7 烟草瞬时表达
2.2.7.1 烟草侵染注射
2.2.7.2 烟草GUS染色
3 结果与分析
3.1 蛋白结构分析
3.2 亲本及杂交F_1 代的花青素与叶绿素含量的比较分析
3.3 与Bj.Pur基因连锁的标记的筛选
3.4 花青素合成相关基因的表达量分析
3.4.1 莲座期不同部位叶片Bj.Pur(BjMYB90)表达量分析
3.4.2 开花期植株不同部位Bj.Pur(BjMYB90)表达量分析
3.4.3 莲座期花青素合成相关基因表达量分析
3.4.4 环境胁迫下花青素合成相关基因在紫叶芥中的表达量分析
3.5 候选基因Bj.Pur(BjMYB90)的遗传转化与功能验证
3.5.1 p35s:P-MYB90 超表达载体的构建
3.5.2 拟南芥遗传转化
3.5.3 芥菜遗传转化
3.6 Bj.Pur(BjMYB90)基因启动子序列的克隆与分析
3.6.1 Bj.Pur(BjMYB90)基因启动子序列的克隆
3.6.2 启动子GUS报告基因载体的构建
3.7 不同芥菜种质资源中产生叶色差异机制的初步探究
3.7.1 插入片段差异的探究
3.7.2 启动子差异的探究
4 讨论
4.1 Bj.Pur基因的功能探究
4.2 芥菜叶色差异机制探究
4.3 后续工作计划
参考文献
附录1 :qPCR过程中所用引物
附录2 :41 份绿色芥菜材料和11 份紫色芥菜材料品种一览表
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]利用CRISPR/Cas9技术敲除拟南芥转录因子MYB40的两种可变剪接体[J]. 李孟湛,尹红菊,李丁丁,刘亚琪,王锁民. 草业学报. 2019(01)
[2]小兰屿蝴蝶兰R2R3-MYB转录因子分析[J]. 王雪霁,梁立雄,李潞滨,王涛. 林业科学研究. 2018(03)
[3]观赏羽衣甘蓝BoMYB114基因编码区的克隆及序列分析[J]. 王玉书,王欢,庞彩燕. 分子植物育种. 2018(14)
[4]芥菜类蔬菜杂种优势利用的研究进展与展望[J]. 万正杰,李海渤,姚培杰,刘旭佳,徐玉颖,傅廷栋,邹瑞昌,徐跃进. 华中农业大学学报. 2018(01)
[5]芥菜类蔬菜产业发展现状及研究前景思考（英文）[J]. 范永红,沈进娟,董代文. Agricultural Science & Technology. 2017(03)
[6]芸薹属物种（B.napus,B.rapa,B.oleracea,B.juncea,B.nigra）MYB28家族的分子进化[J]. 陆俊杏,白辉扬,张涛. 分子植物育种. 2017(02)
[7]植物转录因子MYB基因家族的研究进展[J]. 牛义岭,姜秀明,许向阳. 分子植物育种. 2016(08)
[8]MicroRNA828负调控缺磷胁迫诱导的番茄花青素生物合成[J]. 贾小云,刘慧,沈洁,李芳,丁娜,孙岩,高昌勇,李润植. 中国农业科学. 2015(15)
[9]小麦R2R3-MYB转录因子TaMYB3-4D的克隆及功能分析[J]. 王延谦,张波,陈文杰,刘登才,刘宝龙,张怀刚. 西北植物学报. 2015(04)
[10]R2R3MYB转录因子在果树花青素合成中的调控作用[J]. 李永杰,谢让金,邓烈. 中国南方果树. 2014(06)
博士论文
[1]甜橙CsMYBF1基因的功能鉴定和调控机理研究[D]. 刘朝阳.华中农业大学 2016
[2]番茄花青素缺失基因Hoffman’s Anthocyaninless的图位克隆及功能分析[D]. 邱正坤.中国农业科学院 2016
[3]甘蓝型油菜紫叶基因BnaA.PL1定位和候选基因分析[D]. 李海渤.华中农业大学 2016
[4]桃花青苷着色及原花青素合成的调控机制研究[D]. 周晖.中国科学院研究生院(武汉植物园) 2015
[5]大白菜紫红色基因定位和候选基因分析[D]. 张淑江.中国农业科学院 2014
[6]白菜花青苷和黄酮醇苷自然变异及遗传机制研究[D]. 郭宁.中国农业科学院 2014
[7]小麦MYB转录因子的功能研究[D]. 张立超.中国农业科学院 2013
[8]油菜种子高油酸低亚麻酸的遗传控制及等位基因特异标记开发[D]. 杨庆勇.华中农业大学 2012
[9]芥菜型油菜胞质不育Hau CMS不育相关基因的鉴定及其功能分析[D]. 景兵.华中农业大学 2012
[10]芸薹属植物花青素生物合成代谢途径调控机制的研究[D]. 张彬.重庆大学 2011
硕士论文
[1]草莓FvMYB6-like基因的克隆及功能分析[D]. 石伟佳.沈阳农业大学 2018
[2]苹果MdMYB2基因的克隆及功能鉴定[D]. 曲丰佳.山东农业大学 2018
[3]桑椹花青素合成相关miRNAs的鉴定及其功能研究[D]. 赵怀宁.山东农业大学 2018
[4]玉米ZmMYB59转录因子的亚细胞定位、启动子功能鉴定及在烟草中的表达分析[D]. 孙彩霞.浙江农林大学 2017
[5]芥菜紫叶基因Bj.Pur定位及候选基因分析[D]. 张甜.华中农业大学 2017
[6]番茄SlMYB102基因的克隆及耐盐功能的初步鉴定[D]. 陈丽琛.山东农业大学 2017
[7]辣椒素合成结构基因及MYB转录因子的克隆和功能验证[D]. 周欣.华南农业大学 2016
[8]红梨果皮着色相关R2R3型MYB转录因子基因功能分析[D]. 王智敏.西北农林科技大学 2016
[9]番茄miR858的克隆与干旱应答及其对花青素生物合成的负调控机制研究[D]. 沈洁.山西农业大学 2015
[10]大豆诱导型NAC转录因子基因启动子克隆及功能研究[D]. 杨丹.山东大学 2015
本文编号：3203845
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