苹果葡萄糖感受器MdHXK1磷酸化Na + /H + 交换蛋白MdNHX1调控耐盐性的分子机理

发布时间：2021-06-16 04:27

　　盐渍土是限制苹果果树生长的主要环境因素之一,严重影响我国果树的生产和发展。通过长期进化,植物形成了一系列的耐盐胁迫机制。其中,阳离子/质子转运载体在维持细胞内的离子平衡方面起到关键作用。Na⁺/H⁺交换蛋白在维持细胞内低浓度的Na⁺以避免离子毒害的过程中发挥重要作用。质膜定位的SOS1交换蛋白,通过经典的Salt-overly-sensitive（SOS）途径,介导Na⁺向胞外的流出。定位于液泡上的Na⁺/H⁺交换蛋白,能够将Na⁺隔离到液泡内,降低Na⁺对胞质中细胞器的毒害作用。但是,目前,对于液泡上的Na⁺/H⁺交换蛋白的调控机制研究相对较少。作为光合作用的主要产物,糖类不仅是植物体主要能量物质,也为脂类、蛋白质和核酸的合成提供碳骨架,在植物的生长发育过程中具有重要作用。此外,糖类还是植物应对盐胁迫的主要细胞渗透调节剂之一。近年来,通过遗传学、细胞生物学和一系列的功... 

【文章来源】：山东农业大学山东省

【文章页数】：124 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
符号说明
中文摘要
英文摘要
1 前言
    1.1 土壤盐渍化及其危害
    1.2 植物耐盐机制
        1.2.1 积累渗透调节物
        1.2.2 活性氧清除机制
        1.2.3 离子平衡
        1.2.4 SOS(Salt-Overly-Sensitive)途径
        1.2.5 Na~+/H~+交换蛋白与植物耐盐性
            1.2.5.1 Na~+/H~+交换蛋白(NHX)的分类
            1.2.5.2 Na~+/H~+交换蛋白的生化功能和调控
    1.3 植物中的糖感知与糖信号
        1.3.1 植物中的糖信号的产生
        1.3.2 植物中的糖感知机制
            1.3.2.1 葡萄糖感受器HXK
            1.3.2.2 二糖的感知
            1.3.2.3 细胞表面受体与糖信号
        1.3.3 植物中的糖信号转导
            1.3.3.1 转录调控
            1.3.3.2 蛋白激酶和蛋白磷酸酶在糖信号转导中的作用
        1.3.4 糖信号与植物激素
            1.3.4.1 糖信号与ABA信号
            1.3.4.2 糖信号与乙烯信号
    1.4 研究的目的与意义
2 材料与方法
    2.1 试验材料
        2.1.1 苹果材料
        2.1.2 拟南芥及其生长条件
        2.1.3 酵母及其生长条件
        2.1.4 菌株
        2.1.5 载体
        2.1.6 引物
        2.1.7 所用药品试剂
        2.1.8 培养基
        2.1.9 缓冲液配方
    2.2 试验方法
        2.2.1 植物总RNA的提取
        2.2.2 RNA含量与纯度检测
        2.2.3 基因组DNA的去除
        2.2.4 基因的克隆
        2.2.5 PCR产物回收
        2.2.6 连接反应
        2.2.7 大肠杆菌感受态的制备和转化
        2.2.8 测序
        2.2.9 质粒DNA的提取
        2.2.10 质粒DNA的酶切反应
        2.2.11 表达载体的构建
            2.2.11.1 MdHXK1、MdNHX1过量表达载体的构建
            2.2.11.2 MdHXK1、MdNHX1瞬时沉默表达载体的构建
            2.2.11.3 用于发根农杆菌侵染的pK7GWIWG2载体构建
            2.2.11.4 启动子载体构建
            2.2.11.5 原核表达载体的构建
            2.2.11.6 酵母双杂交载体构建
        2.2.12 农杆菌感受态细胞的制备与转化
        2.2.13 植物材料的准备及转化
            2.2.13.1 苹果王林愈伤组织的培养
            2.2.13.2 苹果愈伤组织的转化
            2.2.13.3 ‘Gala’苹果遗传转化
            2.2.13.4 发根农杆菌MSU440侵染
        2.2.14 酵母双杂
            2.2.14.1 所用相关试剂及配制方法
            2.2.14.2 酵母双杂交步骤
        2.2.15 蛋白相关的试验技术
            2.2.15.1 原核诱导蛋白
            2.2.15.2 原核诱导蛋白纯化
            2.2.15.3 Pull-Down
            2.2.15.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
        2.2.16 植物总蛋白的提取
        2.2.17 蛋白免疫印迹分析(Westernblotting)
            2.2.17.1 转膜
            2.2.17.2 洗膜和显影
        2.2.18 蛋白体外降解
        2.2.19 Co-IP免疫共沉淀
        2.2.20 蛋白磷酸化检测
            2.2.20.1 离体蛋白磷酸化的鉴定(放射性32P同位素标记)
            2.2.20.2 体内蛋白磷酸化的检测(Pro-QDiamondPhosphoproteinGelStain)
        2.2.21 苹果原生质体的提取
            2.2.21.1 原生质体的分离
            2.2.21.2 PEG转化
        2.2.22 Na~+/H~+交换活性检测
            2.2.22.1 液泡膜蛋白的提取
            2.2.22.2 测定Na~+/H~+交换活性
        2.2.23 酵母突变体互补试验
        2.2.24 脯氨酸含量测定
            2.2.24.1 脯氨酸的提取
            2.2.24.2 脯氨酸标准曲线
        2.2.25 MDA含量测定
        2.2.26 Na~+、K+离子含量测定
3 结果与分析
    3.1 外源葡萄糖提高苹果苗的耐盐性
        3.1.1 外源葡萄糖提高苹果苗的耐盐性
        3.1.2 葡萄糖提高苹果苗耐盐性依赖于HXK
    3.2 葡萄糖通过MdHXK1提高苹果耐盐性
        3.2.1 MdHXK1在转录水平和蛋白水平均受盐胁迫的诱导
        3.2.2 反义抑制MdHXK1的表达降低苹果叶片的耐盐性
        3.2.3 MdHXK1主要依赖其信号途径提高耐盐性
    3.3 MdHXK1与MdNHX1互作
        3.3.1 MdHXK1互作蛋白的筛选
        3.3.2 MdHXK1与MdNHX1互作验证
    3.4 MdNHX1的功能鉴定
        3.4.1 MdNHX1基因的分子克隆
        3.4.2 酵母突变体互补验证Na~+/H~+交换蛋白MdNHX1的功能
        3.4.3 MdNHX1的亚细胞定位
        3.4.4 MdNHX1基因的表达模式分析
        3.4.5 过表达MdNHX1提高苹果愈伤的耐盐性
        3.4.6 MdNHX1过表达苹果愈伤中的Na~+/H~+交换活性提高
        3.4.7 异源表达MdNHX1提高拟南芥的耐盐性
    3.5 MdHXK1在275位的丝氨酸磷酸化MdNHX1蛋白
    3.6 MdHXK1影响MdNHX1的蛋白稳定性和转运活性
        3.6.1 MdHXK1提高MdNHX1的蛋白稳定性
        3.6.2 MdHXK1提高MdNHX1的转运活性
        3.6.3 共转MdHXK1与MdNHX1提高酵母突变体的耐盐性
    3.7 MdHXK1提高植物耐盐性部分依赖于MdNHX
        3.7.1 MdHXK1提高苹果愈伤耐盐性
        3.7.2 过表达MdHXK1提高苹果植株的耐盐性
        3.7.3 MdHXK1提高苹果苗的耐盐性部分依赖MdNHX
        3.7.4 反义抑制MdNHX1的表达增加了MdHXK1过表达植株叶片对盐的敏感性
4 讨论
    4.1 葡萄糖信号通过HXK依赖途径提高耐盐性
    4.2 MdHXK1部分通过MdNHX1参与植物耐盐性
    4.3 MdNHX1在维持盐胁迫下细胞内离子稳态过程中起重要作用
5 结论
6 参考文献
7 附录
8 致谢
9 攻读学位期间发表论文情况


【参考文献】：
期刊论文
[1]中国苹果主产区生产布局变迁及影响因素分析[J]. 刘天军,范英.  农业经济问题. 2012(10)
[2]当今世界苹果产业发展趋势及我国苹果产业优质高效发展意见[J]. 陈学森,韩明玉,苏桂林,刘凤之,过国南,姜远茂,毛志泉,彭福田,束怀瑞.  果树学报. 2010(04)
[3]土壤水盐运移模型研究进展[J]. 郭瑞,冯起,司建华,常宗强,席海洋,刘蔚.  冰川冻土. 2008(03)



本文编号：3232356