基于SSR分子标记及qPCR枇杷非整倍体分子核型分析体系的建立
发布时间：2021-06-27 08:11
枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）（2n=2x=34）属于蔷薇科枇杷属植物,是我国南方的主要果树之一,其中枇杷非整倍体对其遗传育种研究具有重要意义。在生物体中,不同基因剂量之间存在微妙而敏感的平衡。通常,整倍体不会改变染色体类型或基因的相对剂量。而非整倍体染色体之间的相对剂量是不平衡。非整倍体通常具有特定于分子核型的新表型。当前,检测植物非整倍体分子核型的技术较少,部分现有的技术成本较高,程序也较为繁琐。因此,建立一种快速、简便的枇杷非整倍体分子核型检测技术十分必要。为此,基于非整倍体染色体之间相对剂量的不平衡,本研究开发了一种新方法用于枇杷非整倍体分子核型的检测,命名为“基于SSR分子标记和qPCR组合（SSR-qPCR）的枇杷非整倍体检测方法”。该方法在三倍体枇杷后代中进行了应用,为枇杷非整倍体的快速检测和分子核型的构建提供了技术支撑。主要试验结果如下:1、qPCR引物的筛选（1）以23个不同倍性枇杷株系（品种）（包括22个整倍体和1个非整倍体H39）的基因组DNA为模板,对209对SSR引物进行PCR扩增,筛出无多态性且扩增稳定的SSR引物17对,该17...
【文章来源】：西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：115 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
一个QF-PCR标记的四个结果[136]
西南大学硕士学位论文8程序可以在同一反应管中对50个不同靶基因同时进行检测。整个流程是首先进行探针杂交，然后进行靶序列探针特异性序列连接，最后进行PCR扩增和毛细管电泳检测。近年来，MLPA已广泛应用在染色体遗传疾并甲基化分析检测等领域[151]。当然，MLPA技术也存在一些局限性，单个目标序列需同时设计长短探针，其中的长探针制备较复杂，另外需核酸杂交，操作比较繁琐而且费时。（4）微阵列比较基因组杂交比较基因组杂交技术（comparativegenomichybridization，CGH）由Kallioniemi[139]于1992年首次建立，近些年来，又提出了微阵列比较基因组杂交技术（microarray-basedcomparativegenomichybridization，array-CGH）。array-CGH技术的整个流程是首先将等量不同荧光标记的待测DNA和参照DNA分别杂交于分布有标准全基因组寡核苷酸探针的微阵列上，再经过扫描仪扫描以及软件分析比较，最终判断待测样本基因组拷贝数的变化（图1-2）。目前主要应用于人类的肿瘤发生和发育畸形等与染色体不平衡相关的研究[140]。该方法可以克服传统细胞学核型分析的局限性，只需一次实验即可对样本在整个基因组的拷贝数变化进行检测。图1-2常规CGH与array-CGH的原理图[152]Fig.1-2SchematicdiagramofconventionalCGHandarray-CGH
第1章文献综述9（5）单核苷酸多态性微阵列2006年，Peiffer首次将高密度SNP基因分型技术引入到基因组图谱中[153]，单核苷酸多态性微阵列（singlenucleotidepolymorphismarray，SNParray）仅需对待测样本DNA进行检测，并与一整套正常基因组对照进行比较即能获得诊断结果。使用array-CGH技术可以较好的检出CNV，相比之下SNParray除能检出CNV外，还可以检出大部分的单亲二倍体、三倍体和一定水平的嵌合体[154-155]。目前，SNParray已逐渐推广应用于临床诊断和产前诊断。当然，SNParray存在以下局限性[156]：（1）由于芯片设计限制，SNParray并不能检出全部已知综合症相关位点的异常，因此SNParray尚不能完全取代传统的核型分析；（2）不能检测出四倍体；（3）低比例嵌合体的检出取决于样本类型、平台种类、DNA质量、数据质量等因素；（4）不能检出平衡易位。（6）实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR（quantitativereal-timepolymerasechainreaction，qPCR）也被广泛应用于非整倍体的检测[142,157-159]。qPCR的原理是分别针对对照样本染色体上的序列（通常为管家基因序列，发生数目异常的概率极小）和待检测染色体上的序列设计不同引物。通过对扩增后两个目标序列对应的Ct值或ΔRn值的比较进而判断染色体数目异常情况。如图1-3，为执行内部标准以实现相对定量。在诊断给定21号染色体的三体时，可以选择其他常染色体的特异性序列作为参照，在qPCR的指数增长期（假设CT=20），三体的ΔRn1值为（2+1）*220，而常染色体的ΔRn2值为2*220，ΔRn1/ΔRn2=1.5，进而判断其为三体（图1-3）。图1-3qPCR检测非整倍体示意图Fig.1-3DetectionofaneuploidyusingqPCR
【参考文献】：
期刊论文
[1]大果无核红肉枇杷新品种‘华金无核1号’[J]. 党江波,郭启高,向素琼,何桥,孙海艳,吴頔,景丹龙,王淑明,夏燕,李晓林,梁国鲁. 园艺学报. 2019(S2)
[2]大果红肉抗病枇杷新品种‘金华3号’[J]. 党江波,郭启高,向素琼,何桥,孙海燕,吴頔,景丹龙,王淑明,夏燕,李晓林,梁国鲁. 园艺学报. 2019(S2)
[3]大果无核枇杷新品种‘华玉无核1号’[J]. 党江波,郭启高,向素琼,何桥,孙海燕,吴頔,景丹龙,王淑明,夏燕,李晓林,梁国鲁. 园艺学报. 2019(S2)
[4]少核高糖红肉枇杷新品种‘金华2号’[J]. 党江波,郭启高,向素琼,何桥,孙海燕,吴頔,景丹龙,王淑明,夏燕,李晓林,梁国鲁. 园艺学报. 2019(S2)
[5]枇杷功能成分及生物活性研究进展[J]. 刘丽丽,刘玉垠,王杰,赵小娜,鲁周民. 食品科学. 2020(05)
[6]Genomic selection methods for crop improvement:Current status and prospects[J]. Xin Wang,Yang Xu,Zhongli Hu,Chenwu Xu. The Crop Journal. 2018(04)
[7]四倍体巨峰系葡萄有核栽培花果管理技术[J]. 陈锦永,程大伟,顾红,张威远,郭西智,张洋,祁帅. 果农之友. 2018(05)
[8]枇杷叶片发育基因EjGRF5与启动子克隆及其在不同倍性枇杷中的表达[J]. 刘超,王玲利,吴頔,党江波,尚维,郭启高,梁国鲁. 中国农业科学. 2018(08)
[9]植物非整倍体研究进展[J]. 朱斌,田贵福,贺路英,李再云. 广西植物. 2018(10)
[10]VIGS诱导PSY基因沉默对枇杷果实类胡萝卜素积累的影响[J]. 洪敏,石丝,何珊珊,文露,池卓恒,唐月明,王永清. 分子植物育种. 2018(06)
博士论文
[1]基于SSR标记的枇杷遗传多样性分析与品种鉴别[D]. 何桥.西南大学 2010
硕士论文
[1]三倍体枇杷实生后代及杂交后代SCoT标记及DNA甲基化分析[D]. 贾志刚.西南大学 2011
[2]枇杷高频率体胚发生体系的建立及其遗传转化初步研究[D]. 沈庆斌.福建农林大学 2005
本文编号：3252476
【文章来源】：西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：115 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
一个QF-PCR标记的四个结果[136]
西南大学硕士学位论文8程序可以在同一反应管中对50个不同靶基因同时进行检测。整个流程是首先进行探针杂交，然后进行靶序列探针特异性序列连接，最后进行PCR扩增和毛细管电泳检测。近年来，MLPA已广泛应用在染色体遗传疾并甲基化分析检测等领域[151]。当然，MLPA技术也存在一些局限性，单个目标序列需同时设计长短探针，其中的长探针制备较复杂，另外需核酸杂交，操作比较繁琐而且费时。（4）微阵列比较基因组杂交比较基因组杂交技术（comparativegenomichybridization，CGH）由Kallioniemi[139]于1992年首次建立，近些年来，又提出了微阵列比较基因组杂交技术（microarray-basedcomparativegenomichybridization，array-CGH）。array-CGH技术的整个流程是首先将等量不同荧光标记的待测DNA和参照DNA分别杂交于分布有标准全基因组寡核苷酸探针的微阵列上，再经过扫描仪扫描以及软件分析比较，最终判断待测样本基因组拷贝数的变化（图1-2）。目前主要应用于人类的肿瘤发生和发育畸形等与染色体不平衡相关的研究[140]。该方法可以克服传统细胞学核型分析的局限性，只需一次实验即可对样本在整个基因组的拷贝数变化进行检测。图1-2常规CGH与array-CGH的原理图[152]Fig.1-2SchematicdiagramofconventionalCGHandarray-CGH
第1章文献综述9（5）单核苷酸多态性微阵列2006年，Peiffer首次将高密度SNP基因分型技术引入到基因组图谱中[153]，单核苷酸多态性微阵列（singlenucleotidepolymorphismarray，SNParray）仅需对待测样本DNA进行检测，并与一整套正常基因组对照进行比较即能获得诊断结果。使用array-CGH技术可以较好的检出CNV，相比之下SNParray除能检出CNV外，还可以检出大部分的单亲二倍体、三倍体和一定水平的嵌合体[154-155]。目前，SNParray已逐渐推广应用于临床诊断和产前诊断。当然，SNParray存在以下局限性[156]：（1）由于芯片设计限制，SNParray并不能检出全部已知综合症相关位点的异常，因此SNParray尚不能完全取代传统的核型分析；（2）不能检测出四倍体；（3）低比例嵌合体的检出取决于样本类型、平台种类、DNA质量、数据质量等因素；（4）不能检出平衡易位。（6）实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR（quantitativereal-timepolymerasechainreaction，qPCR）也被广泛应用于非整倍体的检测[142,157-159]。qPCR的原理是分别针对对照样本染色体上的序列（通常为管家基因序列，发生数目异常的概率极小）和待检测染色体上的序列设计不同引物。通过对扩增后两个目标序列对应的Ct值或ΔRn值的比较进而判断染色体数目异常情况。如图1-3，为执行内部标准以实现相对定量。在诊断给定21号染色体的三体时，可以选择其他常染色体的特异性序列作为参照，在qPCR的指数增长期（假设CT=20），三体的ΔRn1值为（2+1）*220，而常染色体的ΔRn2值为2*220，ΔRn1/ΔRn2=1.5，进而判断其为三体（图1-3）。图1-3qPCR检测非整倍体示意图Fig.1-3DetectionofaneuploidyusingqPCR
【参考文献】：
期刊论文
[1]大果无核红肉枇杷新品种‘华金无核1号’[J]. 党江波,郭启高,向素琼,何桥,孙海艳,吴頔,景丹龙,王淑明,夏燕,李晓林,梁国鲁. 园艺学报. 2019(S2)
[2]大果红肉抗病枇杷新品种‘金华3号’[J]. 党江波,郭启高,向素琼,何桥,孙海燕,吴頔,景丹龙,王淑明,夏燕,李晓林,梁国鲁. 园艺学报. 2019(S2)
[3]大果无核枇杷新品种‘华玉无核1号’[J]. 党江波,郭启高,向素琼,何桥,孙海燕,吴頔,景丹龙,王淑明,夏燕,李晓林,梁国鲁. 园艺学报. 2019(S2)
[4]少核高糖红肉枇杷新品种‘金华2号’[J]. 党江波,郭启高,向素琼,何桥,孙海燕,吴頔,景丹龙,王淑明,夏燕,李晓林,梁国鲁. 园艺学报. 2019(S2)
[5]枇杷功能成分及生物活性研究进展[J]. 刘丽丽,刘玉垠,王杰,赵小娜,鲁周民. 食品科学. 2020(05)
[6]Genomic selection methods for crop improvement:Current status and prospects[J]. Xin Wang,Yang Xu,Zhongli Hu,Chenwu Xu. The Crop Journal. 2018(04)
[7]四倍体巨峰系葡萄有核栽培花果管理技术[J]. 陈锦永,程大伟,顾红,张威远,郭西智,张洋,祁帅. 果农之友. 2018(05)
[8]枇杷叶片发育基因EjGRF5与启动子克隆及其在不同倍性枇杷中的表达[J]. 刘超,王玲利,吴頔,党江波,尚维,郭启高,梁国鲁. 中国农业科学. 2018(08)
[9]植物非整倍体研究进展[J]. 朱斌,田贵福,贺路英,李再云. 广西植物. 2018(10)
[10]VIGS诱导PSY基因沉默对枇杷果实类胡萝卜素积累的影响[J]. 洪敏,石丝,何珊珊,文露,池卓恒,唐月明,王永清. 分子植物育种. 2018(06)
博士论文
[1]基于SSR标记的枇杷遗传多样性分析与品种鉴别[D]. 何桥.西南大学 2010
硕士论文
[1]三倍体枇杷实生后代及杂交后代SCoT标记及DNA甲基化分析[D]. 贾志刚.西南大学 2011
[2]枇杷高频率体胚发生体系的建立及其遗传转化初步研究[D]. 沈庆斌.福建农林大学 2005
本文编号：3252476
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