脂质体介导的遗传转化体系的构建及漆酶在金针菇生长发育过程中的研究

发布时间：2021-08-03 11:10

　　金针菇（Flammulina velutipes）在东南亚乃至全世界范围内都是一种极其重要的食药用真菌。它以其独特的口感和良好的营养、药用价值在东亚尤其是中日韩等国家赢得了众多消费者的喜爱。但由于金针菇中遗传转化体系的缺乏,限制了金针菇的生物学研究进展。本研究首次将脂质体转化方法成功引入到金针菇中,获得了 一个简单有效的金针菇遗传转化体系。在金针菇中,脂质体转化法的转化效率能够高达60-80个转化子/104个原生质体,而电击转化法的转化效率为10-20个转化子/104个原生质体,农杆菌转化法的转化效率仅为5-10个转化子/104个原生质体;脂质体介导的金针菇遗传转化体系5-6天就能观察到转化子,而电击转化方法要到10天时才能发现转化子,农杆菌转化方法则需要两周。相比较而言,脂质体转化方法所需培养时间更短,转化效率更高。为了研究漆酶基因在金针菇生长发育中的作用,本研究使用建立的脂质体转化体系筛选得到漆酶基因的沉默菌株和过表达菌株。在金针菇中共比对到9条漆酶序列,应用RT-PCR检测金针菇中的漆酶基因表达量,结果表明:Lac1,Lac2,Lac3,Lac4的基因表达量较高,而Lac5,La... 

【文章来源】：南京农业大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：70 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
符号和缩略语说明
第一章 文献综述
    第一节 金针菇的概述
        1.1 金针菇的分类地位
        1.2 金针菇的组成部分
            1.2.1 金针菇菌盖形态特征
            1.2.2 金针菇菌褶形态特征
            1.2.3 金针菇菌柄形态特征
        1.3 金针菇营养价值
        1.4 金针菇药用价值
            1.4.1 金针菇具有免疫调节作用
            1.4.2 金针菇具有护肝作用
            1.4.3 金针菇具有抗肿瘤作用
    第二节 脂质体介导的遗传转化研究进展
        2.1 目前丝状真菌中主要的遗传转化方法
            2.1.1 农杆菌介导的转化法
            2.1.2 电击法
            2.1.3 限制酶介导的DNA整合法
        2.2 脂质体转化方法的简介
        2.3 金针菇中遗传转化方法的研究
    第三节 漆酶基因家族的简介
        3.1 漆酶的命名和分类
        3.2 漆酶的特性
        3.3 漆酶基因家族与菌丝生长、子实体形成有关
    第四节 本论文的研究内容及意义
        4.1 研究意义
        4.2 研究内容
第二章 脂质体介导的金针菇遗传转化体系的建立
    前言
    1 实验材料
        1.1 菌株、质粒、试剂
        1.2 菌株培养条件
    2 实验方法
        2.1 金针菇原生质体的制备
        2.2 脂质体介导的金针菇转化体系
        2.3 金针菇电击转化体系
        2.4 农杆菌介导的金针菇转化体系
        2.5 金针菇转化子的分子水平验证
        2.6 GFP报告基因的检测
        2.7 金针菇转化子有丝分裂稳定性验证
    3 结果与分析
        3.1 潮霉素抗性浓度筛选结果
        3.2 脂质体转化结果
        3.3 潮霉素扩增验证随机挑取的转化子
        3.4 转化子绿色荧光的检测
        3.5 金针菇脂质体转化子有丝分裂稳定性验证
        3.6 金针菇三种转化方法转化效率的比较
        3.7 金针菇三种转化方法转化子获得的时间比较
    4 本章讨论
第三章 漆酶基因对金针菇生长发育的影响
    前言
    1 实验材料
        1.1 实验菌株和试剂
        1.2 菌株培养条件
    2 实验方法
        2.1 金针菇基因组DNA的提取(CTAB法)
        2.2 金针菇总RNA的提取和cDNA的反转录
        2.3 Lac2i沉默载体的构建
            2.3.1 Lac2i沉默片段的克隆
            2.3.2 Lac2沉默目的片段双酶切和目的片段的回收
            2.3.3 Lac2沉默质粒的构建
        2.4 Lac2过表达载体的构建
            2.4.1 金针菇cDNA的合成
            2.4.2 Lac2的全长扩增
            2.4.3 载体Fv-GPIE和目的片段的双酶切反应
            2.4.4 目的片段的回收与克隆
            2.4.5 片段与载体的连接
        2.5 Lac2基因沉默载体和过表达载体的脂质体转化
        2.6 转化子的筛选及PCR验证
            2.6.1 金针菇DNA的提取
            2.6.2 转化子的PCR验证
        2.7 转化子中Lac2基因mRNA水平表达量的影响
            2.7.1 金针菇总RNA的提取及cDNA制备
            2.7.2 荧光定量PCR检测转化子沉默效率和过表达效率
        2.8 漆酶活性测定
            2.8.1 平板检测法
            2.8.2 分光光度法测定漆酶的活性
        2.9 纤维素酶活性检测
        2.10 漆酶基因Lac2转化子在生长方面的变化
            2.10.1 不同转化子在平板上的生长差异
            2.10.2 不同转化子在液体发酵中生物量的变化
        2.11 漆酶基因Lac2沉默和过表达转化子的吃料实验
            2.11.1 培养料的配制
            2.11.2 不同转化子吃料能力的比较
        2.12 漆酶基因Lac2沉默和过表达转化子出原基情况
    3 结果与分析
        3.1 金针菇中的漆酶序列
        3.2 金针菇不同漆酶在发酵过程中转录水平差异分析
        3.3 金针菇中漆酶序列相似性比较
        3.4 金针菇漆酶沉默和过表达载体构建过程中部分电泳图
            3.4.1 金针菇总RNA的获得
            3.4.2 金针菇Lac2沉默片段的获取
            3.4.3 金针菇Lac2全长序列的获取
        3.5 漆酶基因Lac2转化子的分子水平验证
        3.6 漆酶基因Lac2、Lac3、Lac4在转化子中转录水平的变化
        3.7 漆酶基因Lac2的沉默转化子和过表达转化子中漆酶活性的变化
            3.7.1 平板检测法
            3.7.2 分光光度法测定漆酶活性
        3.8 漆酶基因的沉默转化子和过表达转化子中纤维素酶活性的变化
        3.9 漆酶基因Lac2沉默转化子和过表达转化子在平板上的生长差异
        3.10 漆酶基因Lac2沉默转化子和过表达转化子生物量的变化
        3.11 漆酶基因Lac2沉默转化子和过表达转化子吃料实验
        3.12 漆酶基因Lac2沉默转化子和过表达转化子原基发生实验
    4 本章讨论
全文总结
参考文献
附录
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]金针菇多糖研究进展[J]. 刘孝永,陈蕾蕾,裘纪莹,孙欣,王未名,周庆新,杜方岭.  中国食物与营养. 2012(05)
[2]金针菇多糖的研究进展[J]. 郑义,李超,王乃馨.  食品科学. 2010(17)
[3]金针菇的化学成分、生物活性及加工研究进展[J]. 蔡和晖,廖森泰,叶运寿,刘学铭.  食品研究与开发. 2008(11)
[4]细菌漆酶的研究进展[J]. 赵敏,魏兴东,汪春蕾,卢磊,杨传平.  中国造纸学报. 2008(03)
[5]金针菇的食用和药用价值研究开发进展[J]. 何轩辉,廖森泰,刘吉平.  广东农业科学. 2008(03)
[6]漆酶在食品工业中的应用[J]. 励建荣,李丹.  现代食品科技. 2006(04)
[7]金针菇多糖对环磷酰胺的增效减毒作用[J]. 袁强,陈芝芸,严茂祥.  中国中药杂志. 2005(12)
[8]真菌漆酶研究进展[J]. 许颖,兰进.  食用菌学报. 2005(01)
[9]金针菇研究概况[J]. 于荣利,秦旭升,宋凤菊.  食用菌学报. 2004(04)
[10]12种常见食用蘑菇脂肪酸绝对含量的测定[J]. 刘江琴,莫丽儿,庄海旗.  广东医学院学报. 2000(02)

博士论文
[1]根癌农杆菌介导的灵芝遗传转化体系的建立及其在灵芝三萜生物合成研究中的应用[D]. 师亮.南京农业大学 2012



本文编号：3319515