新疆沙冬青AnGolS1克
发布时间：2021-10-09 12:50
番茄作为蔬菜栽培中的第一大作物,其适宜的温度范围为13～33℃。在我国设施番茄栽培中,冬春季节的低温成为影响番茄产量与质量的重要限制因子。而普通番茄中抗低温种质资源匮乏,本试验针对从生长在极端低温环境中的新疆沙冬青幼苗低温诱导差减抑制杂交库中分离到的肌醇半乳糖苷合成酶基因EST片段（命名为AnGolS1）利用RACE方法,获得了AnGolS1全长序列（GenBank登录号：GU942748）,分析了基因及其编码蛋白的特性,研究了低温下该基因的表达模式,并在此基础上,将该基因转入栽培番茄中,以期提高栽培番茄对低温的抗性。论文的主要结论如下：（1）根据pET30a（+）具有HIS标签的特性,利用酶切连接的方法构建了pET30a（+）-AnGolS1重组质粒；利用IPTG诱导AnGolS1融合蛋白表达,Ni+树脂纯化融合蛋白并用来催化底物反应；通过HPLC分析不同反应时间产物肌醇半乳糖苷的含量,AnGolS1催化底物反应非常迅速,推测AnGolS1很可能是一个快速反应酶并且酶活性有效时间为40min。（2）利用qRT-PCR技术分析不同胁迫下幼苗根、茎及叶中AnGolS1表达量变化,结果显示...
【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 前言
1.1 低温与植物生长发育
1.1.1 低温影响种子萌发
1.1.2 低温影响植物花器官分化及发育
1.2 低温与植物代谢途径
1.2.1 低温对植物光合作用影响
1.2.2 低温影响植物呼吸作用
1.3 低温与细胞结构
1.4 低温与植物体内代谢物质变化
1.4.1 低温对蛋白质活性影响
1.4.2 低温对激素的影响
1.4.3 低温与可溶性糖
1.5 低温与基因表达
1.5.1 低温胁迫相关转录因子
1.5.2 肌醇半乳糖苷合成酶与低温胁迫
1.6 新疆沙冬青特点
1.7 立题依据及目的意义
2 材料与方法
2.1 新疆沙冬青肌醇半乳糖苷合成酶基因克隆
2.1.1 AnGolS1 EST片段分离
2.1.2 5'RACE扩增
2.1.3 3'RACE扩增
2.1.4 序列拼接及生物信息学分析
2.2 AnGolS1体外酶活性检测
2.2.1 原核表达重组质粒构建
2.2.2 IPTG诱导融合蛋白表达及纯化
2.2.3 催化底物反应及HPLC分析
2.3 qRT-PCR分析不同逆境处理下AnGolS1基因表达量
2.4 低温胁迫下不同组织切片ISH原位杂交
2.4.1 组织切片制备
2.4.2 ISH DIG-labeling probe制备
2.4.3 ISH杂交实验
2.5 AnGolS1转基因番茄遗传转化体系构建
2.5.1 转基因重组载体构建
2.5.2 转基因幼苗培育
2.5.3 转基因番茄T0代鉴定
2.5.4 转基因番茄T0代培育
3 结果与分析
3.1 AnGolS1全长克隆
3.1.1 AnGolS1基因5'-UTR区PCR扩增
3.1.2 AnGolS1基因3'-UTR区PCR扩增
3.1.3 AnGolS1基因全长拼接
3.1.4 生物信息学分析
3.2 AnGolS1体外酶活性分析
3.2.1 pET30a(+)-AnGolS1重组质粒鉴定
3.2.2 AnGolS1融合蛋白表达及纯化电泳检测
3.2.3 体外酶活性检测
3.3 逆境胁迫下AnGolS1基因表达量变化
3.3.1 低温胁迫下幼苗根、茎、叶AnGolS1表达量变化
3.3.2 干旱胁迫下根、茎、叶AnGolS1表达量变化
3.3.3 盐胁迫下根、茎、叶AnGolS1表达量变化
3.4 AnGolS1基因组织细胞定位
3.4.1 ISH杂交正义及反义探针RNA合成
3.4.2 低温胁迫下幼根切片ISH原位杂交
3.4.3 低温胁迫下幼茎切片ISH原位杂交
3.4.4 低温胁迫下幼苗叶片切片ISH原位杂交
3.4.5 低温胁迫下幼苗下胚轴切片ISH原位杂交
3.5 AnGolS1转基因番茄遗传转化
3.5.1 AnGolS1转基因载体检测
3.5.2 T0代转基因番茄植株阳性鉴定
4 讨论
4.1 AnGolS1基因的潜在功能
4.2 逆境下AnGolS1基因表达分析
4.3 低温处理下AnGolS1基因定位分析
4.4 AnGolS1转基因番茄获得
5 结论
参考文献
图版
致谢
本文编号：3426414
【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 前言
1.1 低温与植物生长发育
1.1.1 低温影响种子萌发
1.1.2 低温影响植物花器官分化及发育
1.2 低温与植物代谢途径
1.2.1 低温对植物光合作用影响
1.2.2 低温影响植物呼吸作用
1.3 低温与细胞结构
1.4 低温与植物体内代谢物质变化
1.4.1 低温对蛋白质活性影响
1.4.2 低温对激素的影响
1.4.3 低温与可溶性糖
1.5 低温与基因表达
1.5.1 低温胁迫相关转录因子
1.5.2 肌醇半乳糖苷合成酶与低温胁迫
1.6 新疆沙冬青特点
1.7 立题依据及目的意义
2 材料与方法
2.1 新疆沙冬青肌醇半乳糖苷合成酶基因克隆
2.1.1 AnGolS1 EST片段分离
2.1.2 5'RACE扩增
2.1.3 3'RACE扩增
2.1.4 序列拼接及生物信息学分析
2.2 AnGolS1体外酶活性检测
2.2.1 原核表达重组质粒构建
2.2.2 IPTG诱导融合蛋白表达及纯化
2.2.3 催化底物反应及HPLC分析
2.3 qRT-PCR分析不同逆境处理下AnGolS1基因表达量
2.4 低温胁迫下不同组织切片ISH原位杂交
2.4.1 组织切片制备
2.4.2 ISH DIG-labeling probe制备
2.4.3 ISH杂交实验
2.5 AnGolS1转基因番茄遗传转化体系构建
2.5.1 转基因重组载体构建
2.5.2 转基因幼苗培育
2.5.3 转基因番茄T0代鉴定
2.5.4 转基因番茄T0代培育
3 结果与分析
3.1 AnGolS1全长克隆
3.1.1 AnGolS1基因5'-UTR区PCR扩增
3.1.2 AnGolS1基因3'-UTR区PCR扩增
3.1.3 AnGolS1基因全长拼接
3.1.4 生物信息学分析
3.2 AnGolS1体外酶活性分析
3.2.1 pET30a(+)-AnGolS1重组质粒鉴定
3.2.2 AnGolS1融合蛋白表达及纯化电泳检测
3.2.3 体外酶活性检测
3.3 逆境胁迫下AnGolS1基因表达量变化
3.3.1 低温胁迫下幼苗根、茎、叶AnGolS1表达量变化
3.3.2 干旱胁迫下根、茎、叶AnGolS1表达量变化
3.3.3 盐胁迫下根、茎、叶AnGolS1表达量变化
3.4 AnGolS1基因组织细胞定位
3.4.1 ISH杂交正义及反义探针RNA合成
3.4.2 低温胁迫下幼根切片ISH原位杂交
3.4.3 低温胁迫下幼茎切片ISH原位杂交
3.4.4 低温胁迫下幼苗叶片切片ISH原位杂交
3.4.5 低温胁迫下幼苗下胚轴切片ISH原位杂交
3.5 AnGolS1转基因番茄遗传转化
3.5.1 AnGolS1转基因载体检测
3.5.2 T0代转基因番茄植株阳性鉴定
4 讨论
4.1 AnGolS1基因的潜在功能
4.2 逆境下AnGolS1基因表达分析
4.3 低温处理下AnGolS1基因定位分析
4.4 AnGolS1转基因番茄获得
5 结论
参考文献
图版
致谢
本文编号：3426414
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/yylw/3426414.html
