三种梨病毒实时荧光定量RT-PCR和RT-LAMP检测技术的研究
发布时间：2021-10-25 11:24
苹果茎沟病毒（Apple stem grooving virus）、苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus, ASPV）和苹果褪绿叶斑病毒（Apple cholortotic leaf spot virus, ACLSV）是侵染梨树的三种主要病毒,单一病毒侵染栽培梨时,通常不表现出明显的症状,而两种或三种病毒复合侵染时,有的梨树叶片表现出褪绿斑、脉黄、畸形及卷曲等明显症状。目前,培育和栽培无病毒苗木是防治果树病毒病的有效措施,因此,果树病毒病的检测和诊断具有非常重要的作用。建立灵敏、快速和高通量的病毒检测可为无病毒种苗的繁育提供技术。本研究建立了检测3种梨病毒ASGV、ASPV和ACLSV的实时荧光定量RT-PCR （Reverse transcriptional real time fluorescent quantitative, qRT-PCR）技术及ASPV和ACLSV的环介导等温扩增（Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP）技术,研究结果如下：1、本研究...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语表(Abbreviations)
第一章 文献综述
1.1 三种梨病毒的危害特点
1.2 三种梨病毒的分子特性
1.3 果树病毒检测技术研究进展
1.3.1 核酸分子杂交技术
1.3.2 双链RNA(dsRNA)技术
1.3.3 基因芯片技术
1.3.4 实时荧光定量PCR技术
1.3.5 LAMP技术
1.4 研究目的和意义
第二章 三种梨病毒实时荧光定量RT-PCR检测技术
2.1 材料
2.1.1 供试材料
2.1.2 试剂及仪器
2.2 研究方法
2.2.1 引物设计
2.2.2 总RNA的提取
2.2.3 Dnase Ⅰ消化
2.2.4 RT-PCR扩增
2.2.5 基因克隆
2.2.6 引物用量及反应温度的优化
2.2.7 阳性质粒标准品的构建
2.2.8 标准曲线的绘制
2.2.9 qRT-PCR引物特异性检测
2.2.10 qRT-PCR引物灵敏度验证
2.3 结果与分析
2.3.1 三种梨病毒qRT-PCR检测引物的筛选
2.3.2 引物用量对PCR扩增反应的影响
2.3.3 温度梯度对PCR扩增反应的影响
2.3.4 溶解曲线的分析
2.3.5 标准曲线的绘制
2.3.6 重复性
2.3.7 qRT-PCR检测ASGV、ASPV和ACLSV效果评价
2.3.8 qRT-PCR检测梨三种病毒的效果
2.4 结果与讨论
第三章 ACLSV和ASPV两种病毒的RT-LAMP技术
3.1 材料与方法
3.1.1 供试材料
3.1.2 主要试剂与仪器
3.2 研究方法
3.2.1 引物设计
3.2.2 总RNA提取
3.2.3 RT-PCR扩增
3.2.4 RT-LAMP反应体系的建立及优化
3.2.5 LAMP扩增产物检测
3.2.6 RT-LAMP特异性检测
3.2.7 RT-LAMP检测引物灵敏度验证
3.3 结果与分析
3.3.1 ACLSV和LAMP检测引物的筛选
3.3.2 RT-LAMP检测ACLSV和ASPV反应体系的优化
3.3.3 RT-LAMP检测ACLSV和ASPV效果评价
3.4 结果与讨论
第四章 结论与展望
参考文献
附录A Real-time RT-PCR与单一RT-PCR检测梨样品三种病毒
附录B RT-LAMP与单一RT-PCR检测梨样品三种病毒结果
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]梨树病毒病害及其防控[J]. 洪霓. 中国果业信息. 2013(10)
[2]植物病毒检测技术研究进展分析[J]. 张京宣,曹秀芬,宋涛,纪瑛. 北京农业. 2011(30)
[3]苹果茎痘病毒外壳蛋白的原核表达及抗血清制备[J]. 李丽丽,张志宏,董雅凤,张尊平,范旭东,裴光前. 植物保护学报. 2010(04)
[4]环介导等温扩增技术检测菊花中番茄不孕病毒[J]. 刘佳,黄丛林,吴忠义,张秀海,王永勤. 中国农业科学. 2010(06)
[5]环介导等温基因扩增技术及其在病毒检测中的应用[J]. 周广青,常惠芸,邵军军. 生物技术通讯. 2008(02)
[6]10种植物病毒的基因芯片检测技术研究[J]. 马新颖,汪琳,任鲁风,高文娜,邓丛良,张永江,吴小兵,相宁,周琦. 植物病理学报. 2007(06)
[7]实时荧光RT-PCR一步法检测苹果茎沟病毒[J]. 郭立新,向本春,陈红运,段维军,陈洪俊,朱水芳. 植物病理学报. 2006(01)
[8]植物病毒检测技术研究进展[J]. 王健华,王运勤,吉训聪,刘志昕,郑服丛. 热带农业科学. 2005(03)
[9]DNA芯片技术检测乙型肝炎病毒及丁型肝炎病毒的初步研究[J]. 孙朝晖,郑文岭,张宝,石嵘,马文丽. 中华肝脏病杂志. 2004(09)
[10]梨病毒病研究新进展[J]. 邓晓云,王国平. 果树学报. 2002(05)
本文编号：3457298
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：79 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语表(Abbreviations)
第一章 文献综述
1.1 三种梨病毒的危害特点
1.2 三种梨病毒的分子特性
1.3 果树病毒检测技术研究进展
1.3.1 核酸分子杂交技术
1.3.2 双链RNA(dsRNA)技术
1.3.3 基因芯片技术
1.3.4 实时荧光定量PCR技术
1.3.5 LAMP技术
1.4 研究目的和意义
第二章 三种梨病毒实时荧光定量RT-PCR检测技术
2.1 材料
2.1.1 供试材料
2.1.2 试剂及仪器
2.2 研究方法
2.2.1 引物设计
2.2.2 总RNA的提取
2.2.3 Dnase Ⅰ消化
2.2.4 RT-PCR扩增
2.2.5 基因克隆
2.2.6 引物用量及反应温度的优化
2.2.7 阳性质粒标准品的构建
2.2.8 标准曲线的绘制
2.2.9 qRT-PCR引物特异性检测
2.2.10 qRT-PCR引物灵敏度验证
2.3 结果与分析
2.3.1 三种梨病毒qRT-PCR检测引物的筛选
2.3.2 引物用量对PCR扩增反应的影响
2.3.3 温度梯度对PCR扩增反应的影响
2.3.4 溶解曲线的分析
2.3.5 标准曲线的绘制
2.3.6 重复性
2.3.7 qRT-PCR检测ASGV、ASPV和ACLSV效果评价
2.3.8 qRT-PCR检测梨三种病毒的效果
2.4 结果与讨论
第三章 ACLSV和ASPV两种病毒的RT-LAMP技术
3.1 材料与方法
3.1.1 供试材料
3.1.2 主要试剂与仪器
3.2 研究方法
3.2.1 引物设计
3.2.2 总RNA提取
3.2.3 RT-PCR扩增
3.2.4 RT-LAMP反应体系的建立及优化
3.2.5 LAMP扩增产物检测
3.2.6 RT-LAMP特异性检测
3.2.7 RT-LAMP检测引物灵敏度验证
3.3 结果与分析
3.3.1 ACLSV和LAMP检测引物的筛选
3.3.2 RT-LAMP检测ACLSV和ASPV反应体系的优化
3.3.3 RT-LAMP检测ACLSV和ASPV效果评价
3.4 结果与讨论
第四章 结论与展望
参考文献
附录A Real-time RT-PCR与单一RT-PCR检测梨样品三种病毒
附录B RT-LAMP与单一RT-PCR检测梨样品三种病毒结果
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]梨树病毒病害及其防控[J]. 洪霓. 中国果业信息. 2013(10)
[2]植物病毒检测技术研究进展分析[J]. 张京宣,曹秀芬,宋涛,纪瑛. 北京农业. 2011(30)
[3]苹果茎痘病毒外壳蛋白的原核表达及抗血清制备[J]. 李丽丽,张志宏,董雅凤,张尊平,范旭东,裴光前. 植物保护学报. 2010(04)
[4]环介导等温扩增技术检测菊花中番茄不孕病毒[J]. 刘佳,黄丛林,吴忠义,张秀海,王永勤. 中国农业科学. 2010(06)
[5]环介导等温基因扩增技术及其在病毒检测中的应用[J]. 周广青,常惠芸,邵军军. 生物技术通讯. 2008(02)
[6]10种植物病毒的基因芯片检测技术研究[J]. 马新颖,汪琳,任鲁风,高文娜,邓丛良,张永江,吴小兵,相宁,周琦. 植物病理学报. 2007(06)
[7]实时荧光RT-PCR一步法检测苹果茎沟病毒[J]. 郭立新,向本春,陈红运,段维军,陈洪俊,朱水芳. 植物病理学报. 2006(01)
[8]植物病毒检测技术研究进展[J]. 王健华,王运勤,吉训聪,刘志昕,郑服丛. 热带农业科学. 2005(03)
[9]DNA芯片技术检测乙型肝炎病毒及丁型肝炎病毒的初步研究[J]. 孙朝晖,郑文岭,张宝,石嵘,马文丽. 中华肝脏病杂志. 2004(09)
[10]梨病毒病研究新进展[J]. 邓晓云,王国平. 果树学报. 2002(05)
本文编号：3457298
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