枳低温响应基因ERF109和ZFP1转化柑橘及转基因植株鉴定
发布时间：2021-10-26 19:24
柑橘在我国水果产业中占据了十分重要的经济地位,然而其产量和品质受周期性冻害影响严重。因此,开展柑橘的抗寒育种研究十分重要。遗传转化是获得抗逆种质的途径之一。本研通过根癌农杆菌介导的方法将从枳（Poncirus trifoliata）中克隆的ERF109和ZFP1基因导入柠檬（Citruslimon）,获得了转基因植株并初步进行抗性分析。取得的主要结果如下:1、转化和再生:ERF109基因累计转化柠檬上胚轴800个,获得再生芽体200个;ZFP1基因累计转化柠檬上胚轴600个,获得再生芽体300个。2、再生植株分子鉴定:对再生芽进行PCR阳性鉴定,共得到柠檬转ERF109阳性苗22株,柠檬转ZFP1阳性苗6株。采用半定量PCR和实时定量PCR对部分阳性苗进行目的基因表达量分析,结果表明在转基因阳性植株中,目的基因表达水平比野生型对照均有不同程度的提高。3、ERF109和ZFP1转基因植株抗寒性分析:分别对ERF109和ZFP1柠檬转基因株系和野生型植株进行低温处理,结果表明低温处理后野生型对照的叶片萎蔫更严重,电导率明显高于转基因株系。该结果初步证明了 ERF109和ZFP1转基因柠檬抗...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２?￡７？／７０９－ＰＢ１１２１表达栽体示意图??Ｆｉ．?２?ＥＲＦ１Ｇ９－ＰＢ１１２１?ｅｘｒｅｓｓｉｏｎ?ｖｅｃｔｏｒ?ｍａ
之后进行进一步的扩繁（附录Ｉ－Ｆ）。??３．１．２转基因材料阳性鉴定??本实验使用两对特异基因引物对转基因系分别进行基因组ＰＣＲ扩增。如图３所??示，五川９和ＭＴ／／基因均从部分待检测株系中扩增出了与质粒ＤＮＡ??大小相同的片段，片段大小分别为１７００?ｂｐ和７４０?ｂｐ，而在野生对照植株则没有出??现相应的片段，表明沿？Ｆ川９己经成功整合到柠檬基因组中。??Ｍ?Ｐ?水?ＷＴ?＃６?＃１２?＃１３?＃１４?＃１５?＃１８?＃２３?＃２９＃３８?＃４０?＃４１?＃４２?＃４５?＃４８??图３转基因株系分子鉴定。Ａ：特异基因引物仍的ＰＣＲ扩增，ＢｓＭＴ／／引物ＰＣＲ??扩增，Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ，?Ｐ：质粒，其他：转基因株系??Ｆｉｇ．?３?Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ?ｌｉｎｅｓ．?Ａ：?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ?ｐｌａｎｔｓ?ｖｉａ??ｓｐｅｃｉｆｉｃ?ｐｒｉｍｅｒｓ?ｏｆ?ＣａＭＶ３５Ｓ－ＥＲＦ１０９，?Ｂ：?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ?ｐｌａｎｔｓ?ｖｉａ?ｓｐｅｃｉｆｉｃ?ｐｒｉｍｅｒｓ??ｏｆ?ＮＰＴＩＩ，?Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ，?Ｐ：?Ｐｌａｓｍｉｄ，?Ｏｔｈｅｒｓ：?ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ?
３．１．３转基因材料表达量分析??将鉴定出的阳性株系的ＲＮＡ提取出来，经反转录成ｃＤＮＡ之后作为模板，分??别通过半定量（图４）和定量（图５）的方法对其进行表达量分析。??ＷＴ?＃６?＃１３?＃３８?＃４０??Ａｃｔｉｎ?．、?＇?＇??图４?基因在ＷＴ及转基因株系中的表达分析??Ｆｉｇ．?４?Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＥＲＦ１０９?ｉｎ?ｔｈｅ?ＷＴ?ａｎｄ?ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ?ｌｉｎｅｓ??１５????１４?－?．？??１３?－??Ｃ／５?＞?－４?＾??１２??＾?１１．?￡?ｆ久??１?：：??ｃｌ?７?．??Ｓ?５?＊?ＫＨ??Ｉ?＾??違?｜［?Ｍ?Ｉ?Ｉ?■??ＷＴ?＃６?＃１３?＃３８??图５实时定量检测基因的表达量??Ｆｉｇ．?５?Ｔｈｅ?ｒｅｌａｔｉｖｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｌｅｖｅｌｓ?ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ?ｂｙ?ｑＲＴ－ＰＣＲ??本研究采用实时定量ＰＣＲ检测了基因在幻？Ｆ川９转基因株系及野生型植株中表??达水平。如图５所示，转基因株系中基因的表达量均高于野生型对照。这个结果表??明外源基因在转基因柠檬中能够正常表达，但是表达水平在不同转基因系中差异较??大。??２７??
【参考文献】：
期刊论文
[1]植物非生物逆境相关锌指蛋白基因的研究进展[J]. 向建华,李灵之,陈信波. 核农学报. 2012(04)
[2]植物AP2/ERF类转录因子研究进展[J]. 张计育,王庆菊,郭忠仁. 遗传. 2012(07)
[3]ERF转录因子在植物对生物和非生物胁迫反应中的作用[J]. 莫纪波,李大勇,张慧娟,宋凤鸣. 植物生理学报. 2011(12)
[4]锌指蛋白结构及功能研究进展[J]. 赵楠,赵飞,李玉花. 生物技术通讯. 2009(01)
[5]植物抗寒基因工程研究进展[J]. 陈儒钢,巩振辉,逯明辉,李大伟,黄炜. 西北植物学报. 2008(06)
[6]不同根癌农杆菌菌株对柑橘愈伤组织遗传转化效率的影响[J]. 李东栋,石玮,邓秀新,伊华林. 华中农业大学学报. 2002(04)
[7]柑橘转基因研究的现状及展望[J]. 蒋迪,徐昌杰,陈大明,张上隆. 果树学报. 2002(01)
[8]植物抗冻机理研究新进展:抗冻基因表达及其功能[J]. 邓江明,简令成. 植物学通报. 2001(05)
[9]越冬期间无花果枝条电解质渗出率与超氧化物歧化酶活性的关系[J]. 姜卫兵,王业遴,马凯. 南京农业大学学报. 1992(01)
博士论文
[1]枳（Poncirus trifoliata）低温相关microRNAs鉴定及ptf-miR396b抗寒功能研究[D]. 张晓娜.华中农业大学 2015
[2]农杆菌介导的MdSPDS1、AhBADH、PtrICE1基因转化柑橘及转基因植株抗性机理研究[D]. 付行政.华中农业大学 2011
[3]柑橘CBF类似基因低温胁迫下的表达与分析[D]. 何利刚.华中农业大学 2010
[4]根癌农杆菌介导的柑橘转化体系优化与转LFY、AP1基因植株的培育[D]. 段艳欣.华中农业大学 2006
[5]ERF转录因子TSRF1的功能分析[D]. 张洪博.中国农业大学 2005
[6]抗寒基因的克隆及根癌农杆菌介导的ICE1基因转化柑橘的研究[D]. 黄家权.华中农业大学 2005
硕士论文
[1]纽荷尔脐橙主产区果实品质特征与产地识别研究[D]. 廖秋红.西南大学 2014
[2]枳PtrbHLH基因的抗寒功能鉴定[D]. 张倩.华中农业大学 2012
[3]转MdSPDS1基因柑橘在低、高温下抗性表现[D]. 刘佳.华中农业大学 2007
[4]根癌农杆菌介导亚精胺合成酶基因MdSPDS1的柑橘遗传转化及离体再生[D]. 瞿金旺.华中农业大学 2006
[5]利用柑橘茎段诱导不定芽改进微芽嫁接脱毒技术的研究[D]. 陈泽雄.华中农业大学 2005
本文编号：3460069
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图２?￡７？／７０９－ＰＢ１１２１表达栽体示意图??Ｆｉ．?２?ＥＲＦ１Ｇ９－ＰＢ１１２１?ｅｘｒｅｓｓｉｏｎ?ｖｅｃｔｏｒ?ｍａ
之后进行进一步的扩繁（附录Ｉ－Ｆ）。??３．１．２转基因材料阳性鉴定??本实验使用两对特异基因引物对转基因系分别进行基因组ＰＣＲ扩增。如图３所??示，五川９和ＭＴ／／基因均从部分待检测株系中扩增出了与质粒ＤＮＡ??大小相同的片段，片段大小分别为１７００?ｂｐ和７４０?ｂｐ，而在野生对照植株则没有出??现相应的片段，表明沿？Ｆ川９己经成功整合到柠檬基因组中。??Ｍ?Ｐ?水?ＷＴ?＃６?＃１２?＃１３?＃１４?＃１５?＃１８?＃２３?＃２９＃３８?＃４０?＃４１?＃４２?＃４５?＃４８??图３转基因株系分子鉴定。Ａ：特异基因引物仍的ＰＣＲ扩增，ＢｓＭＴ／／引物ＰＣＲ??扩增，Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ，?Ｐ：质粒，其他：转基因株系??Ｆｉｇ．?３?Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ?ｌｉｎｅｓ．?Ａ：?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ?ｐｌａｎｔｓ?ｖｉａ??ｓｐｅｃｉｆｉｃ?ｐｒｉｍｅｒｓ?ｏｆ?ＣａＭＶ３５Ｓ－ＥＲＦ１０９，?Ｂ：?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ?ｐｌａｎｔｓ?ｖｉａ?ｓｐｅｃｉｆｉｃ?ｐｒｉｍｅｒｓ??ｏｆ?ＮＰＴＩＩ，?Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ，?Ｐ：?Ｐｌａｓｍｉｄ，?Ｏｔｈｅｒｓ：?ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ?
３．１．３转基因材料表达量分析??将鉴定出的阳性株系的ＲＮＡ提取出来，经反转录成ｃＤＮＡ之后作为模板，分??别通过半定量（图４）和定量（图５）的方法对其进行表达量分析。??ＷＴ?＃６?＃１３?＃３８?＃４０??Ａｃｔｉｎ?．、?＇?＇??图４?基因在ＷＴ及转基因株系中的表达分析??Ｆｉｇ．?４?Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＥＲＦ１０９?ｉｎ?ｔｈｅ?ＷＴ?ａｎｄ?ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ?ｌｉｎｅｓ??１５????１４?－?．？??１３?－??Ｃ／５?＞?－４?＾??１２??＾?１１．?￡?ｆ久??１?：：??ｃｌ?７?．??Ｓ?５?＊?ＫＨ??Ｉ?＾??違?｜［?Ｍ?Ｉ?Ｉ?■??ＷＴ?＃６?＃１３?＃３８??图５实时定量检测基因的表达量??Ｆｉｇ．?５?Ｔｈｅ?ｒｅｌａｔｉｖｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｌｅｖｅｌｓ?ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ?ｂｙ?ｑＲＴ－ＰＣＲ??本研究采用实时定量ＰＣＲ检测了基因在幻？Ｆ川９转基因株系及野生型植株中表??达水平。如图５所示，转基因株系中基因的表达量均高于野生型对照。这个结果表??明外源基因在转基因柠檬中能够正常表达，但是表达水平在不同转基因系中差异较??大。??２７??
【参考文献】：
期刊论文
[1]植物非生物逆境相关锌指蛋白基因的研究进展[J]. 向建华,李灵之,陈信波. 核农学报. 2012(04)
[2]植物AP2/ERF类转录因子研究进展[J]. 张计育,王庆菊,郭忠仁. 遗传. 2012(07)
[3]ERF转录因子在植物对生物和非生物胁迫反应中的作用[J]. 莫纪波,李大勇,张慧娟,宋凤鸣. 植物生理学报. 2011(12)
[4]锌指蛋白结构及功能研究进展[J]. 赵楠,赵飞,李玉花. 生物技术通讯. 2009(01)
[5]植物抗寒基因工程研究进展[J]. 陈儒钢,巩振辉,逯明辉,李大伟,黄炜. 西北植物学报. 2008(06)
[6]不同根癌农杆菌菌株对柑橘愈伤组织遗传转化效率的影响[J]. 李东栋,石玮,邓秀新,伊华林. 华中农业大学学报. 2002(04)
[7]柑橘转基因研究的现状及展望[J]. 蒋迪,徐昌杰,陈大明,张上隆. 果树学报. 2002(01)
[8]植物抗冻机理研究新进展:抗冻基因表达及其功能[J]. 邓江明,简令成. 植物学通报. 2001(05)
[9]越冬期间无花果枝条电解质渗出率与超氧化物歧化酶活性的关系[J]. 姜卫兵,王业遴,马凯. 南京农业大学学报. 1992(01)
博士论文
[1]枳（Poncirus trifoliata）低温相关microRNAs鉴定及ptf-miR396b抗寒功能研究[D]. 张晓娜.华中农业大学 2015
[2]农杆菌介导的MdSPDS1、AhBADH、PtrICE1基因转化柑橘及转基因植株抗性机理研究[D]. 付行政.华中农业大学 2011
[3]柑橘CBF类似基因低温胁迫下的表达与分析[D]. 何利刚.华中农业大学 2010
[4]根癌农杆菌介导的柑橘转化体系优化与转LFY、AP1基因植株的培育[D]. 段艳欣.华中农业大学 2006
[5]ERF转录因子TSRF1的功能分析[D]. 张洪博.中国农业大学 2005
[6]抗寒基因的克隆及根癌农杆菌介导的ICE1基因转化柑橘的研究[D]. 黄家权.华中农业大学 2005
硕士论文
[1]纽荷尔脐橙主产区果实品质特征与产地识别研究[D]. 廖秋红.西南大学 2014
[2]枳PtrbHLH基因的抗寒功能鉴定[D]. 张倩.华中农业大学 2012
[3]转MdSPDS1基因柑橘在低、高温下抗性表现[D]. 刘佳.华中农业大学 2007
[4]根癌农杆菌介导亚精胺合成酶基因MdSPDS1的柑橘遗传转化及离体再生[D]. 瞿金旺.华中农业大学 2006
[5]利用柑橘茎段诱导不定芽改进微芽嫁接脱毒技术的研究[D]. 陈泽雄.华中农业大学 2005
本文编号：3460069
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