LSV 16kDa/TGB1抗血清制备及RNA沉默抑制子的鉴定
发布时间：2021-10-27 02:25
百合无症病毒（Lily symptomless virus, LSV）是香石竹潜隐病毒属（Carlavirus）中的一种,能够严重危害百合种球质量和鲜切花品质,是侵染百合的三大病毒之一。病毒为单链正义RNA,含有6个开放阅读框（ORF）,编码4个蛋白,依5’至3’分别编码：RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）,三基因连锁运动蛋白（TGB1-3）,外壳蛋白（CP）和未知功能蛋白（16kDa）。本研究以感染LSV的百合叶片为试材,通过RT-PCR克隆LSV基因16kDa。将该基因连接至原核表达载体pET-28a（+）,重组载体转化大肠杆菌BL21（DE3）, IPTG诱导表达并通过SDS-PAGE及质谱分析,证明得到高效表达的16kDa融合蛋白,蛋白以包涵体形式存在。经镍柱纯化后得到纯度较高的蛋白。将纯化蛋白16kDa和TGB1分别作为抗原免疫小鼠,制备16kDa和TGB1蛋白抗血清,间接ELISA检测抗血清效价较高。通过Western blot分析,制备的特异性抗血清能与16kDa, TGB1以及百合叶片总蛋白反应,均出现目的杂交条带。制备的抗血清可用于病毒检测、蛋白质印迹、免疫组织化学...
【文章来源】：大连理工大学辽宁省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：83 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
1 文献综述
1.1 百合及病毒防治
1.1.1 百合概述
1.1.2 百合病毒的危害
1.1.3 百合病毒的检测
1.1.4 百合病毒的防治
1.2 百合无症病毒概述
1.2.1 百合无症病毒编码蛋白结构及功能
1.2.2 16kDa,TGB1蛋白研究进展
1.3 RNA沉默抑制子概述
1.3.1 植物病毒沉默抑制子的发现
1.3.2 沉默抑制子作用机制
1.3.3 沉默抑制子的鉴定法
1.3.4 沉默抑制子研究进展
1.3.5 细胞定位
1.4 研究目的、意义及内容
1.4.1 研究目的、意义
1.4.2 研究内容
2 百合无症病毒16kDa蛋白原核表达及纯化
2.1 实验材料与试剂
2.1.1 实验材料
2.1.2 实验试剂
2.2 实验仪器
2.3 实验方法
2.3.1 原核表达载体pET28a-16kDa的构建
2.3.2 融合蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测
2.3.3 融合蛋白的Western blot检测
2.3.4 融合蛋白16kDa质谱分析
2.3.5 融合蛋白的纯化
2.3.6 纯化蛋白浓度的测定
2.4 实验结果与分析
2.4.1 原核表达载体pET28a-16kDa的构建
2.4.2 融合蛋白的诱导表达及SDS-PAGE电泳检测
2.4.3 融合蛋白的Western blot检测
2.4.4 融合蛋白16kDa质谱分析
2.4.5 融合蛋白的纯化
2.4.6 纯化蛋白浓度的测定
2.5 讨论
2.6 小结
3 百合无症病毒16kDa,TGB1蛋白抗血清制备及检测
3.1 实验材料与试剂
3.2 实验仪器
3.3 实验方法
3.3.1 16 kDa,TGB1抗血清制备及抗血清效价测定
3.3.2 Western blot检测
3.3.3 百合无症病毒检测
3.4 实验结果与分析
3.4.1 16 kDa,TGB1抗血清制备及抗血清效价测定
3.4.2 Western blot检测
3.4.3 百合无症病毒检测
3.5 讨论
3.6 小结
4 百合无症病毒16kDa,TGB1沉默抑制子的鉴定与研究
4.1 实验材料与试剂
4.2 实验仪器
4.3 实验方法
4.3.1 重组载体构建
4.3.2 农杆菌浸润接种及鉴定
4.3.3 实时定量PCR检测
4.3.4 Western blot分析
4.3.5 细胞定位
4.4 实验结果与分析
4.4.1 重组载体构建
4.4.2 RNA沉默抑制子的鉴定
4.4.3 细胞定位
4.5 讨论
4.6 小结
5 结论与展望
5.1 结论
5.2 展望
参考文献
附录A 论文病毒序列
附录B 质粒图谱及实验所用Marker
攻读硕士学位期间发表学术论文情况
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]百合病毒编码蛋白及抗病性研究进展[J]. 徐品三,冀文婕,张郑瑶,姜旭. 中国农学通报. 2015(08)
[2]百合病毒病媒介昆虫的研究[J]. 朱亚灵. 中国园艺文摘. 2013(10)
[3]百合病毒病检测技术研究进展[J]. 源朝政,陈海霞,吕长平,蒋辉. 湖南农业科学. 2013(09)
[4]基因工程技术培育抗病毒马铃薯种质的研究进展[J]. 熊伟,左绍远. 平顶山学院学报. 2013(02)
[5]侵染浙贝母3种病毒CP基因的原核表达、抗血清制备及其病毒检测[J]. 吴琪瑶,韦传宝,李进华. 植物研究. 2013(01)
[6]百合无症病毒大连分离物全基因组克隆及其序列分析[J]. 徐品三,吕文霞,夏秀英,李焕改,贾娟. 植物病理学报. 2012(06)
[7]马铃薯抗病毒机制研究进展[J]. 聂碧华,谢从华,聂先舟. 园艺学报. 2012(09)
[8]百合无症病毒衣壳蛋白基因克隆和蛋白分析[J]. 徐品三,刘纪文,高晓蓉,尹雅蕾. 大连理工大学学报. 2012(04)
[9]基因芯片技术检测黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒和马铃薯Y病毒[J]. 贾慧,王艳辉,王进忠,王升启,董金皋. 华北农学报. 2011(01)
[10]Gateway技术快速构建百合双价抗病毒RNAi表达载体[J]. 徐品三,白建芳,刘纪文,李焕改. 中国农学通报. 2011(04)
硕士论文
[1]LSV感染百合生理生化检测及病理学观察[D]. 贾娟.大连理工大学 2013
[2]番茄斑萎病毒和番茄环纹斑点病毒细胞病理学及其运动蛋白的研究[D]. 尚卫娜.浙江大学 2012
[3]利用GISH和SRAP分子标记技术鉴定20个百合杂交F1的代亲本类型[D]. 于晖.西南大学 2010
[4]农杆菌介导NPR1基因对百合遗传转化的研究[D]. 王莎莎.东北农业大学 2008
[5]侵染百合和水仙的部分线状植物病毒外壳蛋白基因的原核表达、抗血清制备及检测应用[D]. 沈嘉乐.浙江大学 2006
[6]百合无症病毒的RT-PCR和核酸杂交检测及其外壳蛋白在大肠杆菌中的表达[D]. 李燕.西北农林科技大学 2005
本文编号：3460681
【文章来源】：大连理工大学辽宁省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：83 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
1 文献综述
1.1 百合及病毒防治
1.1.1 百合概述
1.1.2 百合病毒的危害
1.1.3 百合病毒的检测
1.1.4 百合病毒的防治
1.2 百合无症病毒概述
1.2.1 百合无症病毒编码蛋白结构及功能
1.2.2 16kDa,TGB1蛋白研究进展
1.3 RNA沉默抑制子概述
1.3.1 植物病毒沉默抑制子的发现
1.3.2 沉默抑制子作用机制
1.3.3 沉默抑制子的鉴定法
1.3.4 沉默抑制子研究进展
1.3.5 细胞定位
1.4 研究目的、意义及内容
1.4.1 研究目的、意义
1.4.2 研究内容
2 百合无症病毒16kDa蛋白原核表达及纯化
2.1 实验材料与试剂
2.1.1 实验材料
2.1.2 实验试剂
2.2 实验仪器
2.3 实验方法
2.3.1 原核表达载体pET28a-16kDa的构建
2.3.2 融合蛋白的诱导表达及SDS-PAGE检测
2.3.3 融合蛋白的Western blot检测
2.3.4 融合蛋白16kDa质谱分析
2.3.5 融合蛋白的纯化
2.3.6 纯化蛋白浓度的测定
2.4 实验结果与分析
2.4.1 原核表达载体pET28a-16kDa的构建
2.4.2 融合蛋白的诱导表达及SDS-PAGE电泳检测
2.4.3 融合蛋白的Western blot检测
2.4.4 融合蛋白16kDa质谱分析
2.4.5 融合蛋白的纯化
2.4.6 纯化蛋白浓度的测定
2.5 讨论
2.6 小结
3 百合无症病毒16kDa,TGB1蛋白抗血清制备及检测
3.1 实验材料与试剂
3.2 实验仪器
3.3 实验方法
3.3.1 16 kDa,TGB1抗血清制备及抗血清效价测定
3.3.2 Western blot检测
3.3.3 百合无症病毒检测
3.4 实验结果与分析
3.4.1 16 kDa,TGB1抗血清制备及抗血清效价测定
3.4.2 Western blot检测
3.4.3 百合无症病毒检测
3.5 讨论
3.6 小结
4 百合无症病毒16kDa,TGB1沉默抑制子的鉴定与研究
4.1 实验材料与试剂
4.2 实验仪器
4.3 实验方法
4.3.1 重组载体构建
4.3.2 农杆菌浸润接种及鉴定
4.3.3 实时定量PCR检测
4.3.4 Western blot分析
4.3.5 细胞定位
4.4 实验结果与分析
4.4.1 重组载体构建
4.4.2 RNA沉默抑制子的鉴定
4.4.3 细胞定位
4.5 讨论
4.6 小结
5 结论与展望
5.1 结论
5.2 展望
参考文献
附录A 论文病毒序列
附录B 质粒图谱及实验所用Marker
攻读硕士学位期间发表学术论文情况
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]百合病毒编码蛋白及抗病性研究进展[J]. 徐品三,冀文婕,张郑瑶,姜旭. 中国农学通报. 2015(08)
[2]百合病毒病媒介昆虫的研究[J]. 朱亚灵. 中国园艺文摘. 2013(10)
[3]百合病毒病检测技术研究进展[J]. 源朝政,陈海霞,吕长平,蒋辉. 湖南农业科学. 2013(09)
[4]基因工程技术培育抗病毒马铃薯种质的研究进展[J]. 熊伟,左绍远. 平顶山学院学报. 2013(02)
[5]侵染浙贝母3种病毒CP基因的原核表达、抗血清制备及其病毒检测[J]. 吴琪瑶,韦传宝,李进华. 植物研究. 2013(01)
[6]百合无症病毒大连分离物全基因组克隆及其序列分析[J]. 徐品三,吕文霞,夏秀英,李焕改,贾娟. 植物病理学报. 2012(06)
[7]马铃薯抗病毒机制研究进展[J]. 聂碧华,谢从华,聂先舟. 园艺学报. 2012(09)
[8]百合无症病毒衣壳蛋白基因克隆和蛋白分析[J]. 徐品三,刘纪文,高晓蓉,尹雅蕾. 大连理工大学学报. 2012(04)
[9]基因芯片技术检测黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒和马铃薯Y病毒[J]. 贾慧,王艳辉,王进忠,王升启,董金皋. 华北农学报. 2011(01)
[10]Gateway技术快速构建百合双价抗病毒RNAi表达载体[J]. 徐品三,白建芳,刘纪文,李焕改. 中国农学通报. 2011(04)
硕士论文
[1]LSV感染百合生理生化检测及病理学观察[D]. 贾娟.大连理工大学 2013
[2]番茄斑萎病毒和番茄环纹斑点病毒细胞病理学及其运动蛋白的研究[D]. 尚卫娜.浙江大学 2012
[3]利用GISH和SRAP分子标记技术鉴定20个百合杂交F1的代亲本类型[D]. 于晖.西南大学 2010
[4]农杆菌介导NPR1基因对百合遗传转化的研究[D]. 王莎莎.东北农业大学 2008
[5]侵染百合和水仙的部分线状植物病毒外壳蛋白基因的原核表达、抗血清制备及检测应用[D]. 沈嘉乐.浙江大学 2006
[6]百合无症病毒的RT-PCR和核酸杂交检测及其外壳蛋白在大肠杆菌中的表达[D]. 李燕.西北农林科技大学 2005
本文编号：3460681
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/yylw/3460681.html
